利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点

李杰，张义全，高鹤，王丽，胡小许 ，周冬生

1.中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

基因是遗传物质的最小功能单位，它通过转录和翻译而对生物体表型产生专一性效应。转录是DNA指导下的RNA合成过程，起始于DNA模板的一个特定起点，即基因的转录起始位点。对原核生物而言，其mRNA 5′端的碱基即为其转录起始位点。

在前期研究中[1-5]，我们通常采用引物延伸实验来确定基因的转录起始位点。但引物延伸实验需要利用放射性核素对特异性引物的5′端进行标记，这不仅极易产生放射性废物污染，而且对实验者的健康也有较大伤害。因此，该方法并不是寻找基因转录起始位点的最优选择。5′-cDNA末端快速扩增（5′-rapid-amplification of cDNA ends，5′-RACE）实验也可以用来确定基因的转录起始位点，该方法通过在mRNA的5′端连接接头（Adapter），而后联合利用逆转录、巢式PCR和DNA测序技术，即可最终确定基因的转录起始位点，具有灵敏度高和特异性好的优点。然而，目前市售5′-RACE试剂盒均是针对真核生物mRNA的帽子结构而设计的。由于细菌的mRNA无帽子结构，市售试剂盒并不能直接应用于原核生物。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP菌）是一种广泛分布于浅海海域及海产品中的革兰阴性弧菌，也是引起食物中毒的首要病原菌，能引起以腹泻为主要症状的急性胃肠炎[6]。VP菌具有多种毒力因子，主要包括Ⅲ型分泌系统（T3SS1和T3SS2）、直接耐热溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）。ToxR（VP0820编码）是VP菌的毒力转录调控子，能调节TDH和T3SS1相关基因的表达[7-8]。VP菌具有很强的生物膜形成能力，以抵抗不利的生存环境。作为第二信使，c-di-GMP能促进生物膜的形成。VP菌有数十个蛋白参与c-di-GMP的分子代谢，包括ScrC[9]、ScrG[10]及 VPA0198。ScrC 由操纵子 scrABC编码，主要具有磷酸二酯酶活性，能降解c-di-GMP，抑制胞外多糖CPS（cps操纵子编码，cpsA是其首基因）的合成，从而抑制生物膜的形成[9，11]；ScrG也主要表现为磷酸二酯酶活性，参与降解c-di-GMP[10]；VPA0198在c-di-GMP代谢中的功能还不是很清楚，可能主要参与c-di-GMP的合成。VP菌Ⅵ型分泌系统2（T6SS2）基因位点包含3个操纵子，分别为VPA1027-1024、VPA1043-1028和VPA1044-1046，该系统是其主要的黏附因子之一[12]。

在本研究中，我们以VP菌VP0820、VPA1027、scrC、scrG、cpsA及VPA0198为研究对象，在Ambion公司FirstChoice RLM-RACE试剂盒基础上，通过优化实验条件，摸索出一个适用于原核生物的5′-RACE实验方法。

1 材料和方法

1.1 材料

VP 菌 RIMD2210633（tdh+，KP+）和大肠杆菌DH5α由本实验室保存；HI肉汤培养基（2.5%Difco Heart Infusion Broth）购自BD公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker为TaKaRa公司产品；PCR产物回收试剂盒为QIAGEN产品；DNA-free试剂盒和FirstChoice RLM-RACE试剂盒为Ambion公司产品；TRIzol试剂为Invitrogen公司产品；pGEM-T Easy Vector SystemⅠ（T载体）、Primer Extension System、fmol DNA Cycle Sequencing System等为Promega公司产品。

1.2 细菌培养与RNA提取

取20 μL甘油菌种接种于15 mL HI肉汤培养基中，37℃、200 r/min培养12～14 h（至平台期），而后以1∶1000稀释，接种至新鲜的15 mL HI肉汤中，37℃、200 r/min培养至D600nm约为1.0，收集菌体，用TRIzol试剂[1]提取细菌总RNA，总RNA质量用1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳监测。

1.3 消化DNA

用DNA-free试剂盒去除总RNA中的DNA，50 μL 实验体系包括 5 μL 10×DNaseⅠ缓冲液、2.5 μL rDNaseⅠ、6～8 μg总RNA、1 μL RNase抑制剂，用无核酸酶水补足。37℃孵育30 min后，加入100 μL无核酸酶水和150 μL酚∶氯仿（1∶1），充分混匀，室温12 000 r/min离心5 min，将上层水相转入新的离心管中，加入150 μL氯仿，充分混匀，离心后取上层水相，加入150 μL异丙醇，充分混匀，12 000 r/min离心20 min，RNA沉淀用0.5 mL 70%乙醇漂洗1次，最后用10 μL无核酸酶水溶解。

1.4 Adapter的连接

将已知序列的寡核苷酸片段（Adapter）连接至RNA的5′端，反应体系包括4 μL总RNA、1 μL 5′-RACE Adapter、1 μL 10×RNA 连接酶缓冲液、2 μL T4RNA连接酶（2.5 U/μL），补加无核酸酶水至10 μL。温和混匀，37℃孵育1 h后，直接用于逆转录反应。

1.5 逆转录反应

将连接有Adapter的总RNA逆转录成cDNA，反应体系包括 2 μL 上述经处理的总 RNA、4 μL dNTP、2 μL 随机十聚体（random decamers）、2 μL 10×逆转录缓冲液、1 μL RNase抑制剂、1 μL MMLV逆转录酶，补加无核酸酶水至20 μL。轻轻混匀，42℃孵育1 h。cDNA产物可直接用于PCR反应。此步应有不加逆转录酶的阴性对照。

1.6 巢式PCR反应

采用巢式PCR方法扩增目的基因。第一轮PCR体系包括0.5 μL cDNA模板、2.5 μL 10×PCR缓冲液、2 μL dNTP、10 μmol/L基因特异性外引物和位于Adpater上的外引物（表1）各1 μL、0.75 U DNA聚合酶，补加去离子水至25 μL。第二轮PCR体系包括0.5 μL第一轮PCR产物（无须纯化回收）、5 μL 10×PCR缓冲液、4 μL dNTP、10 μmol/L基因特异性内引物和位于Adpater上的内引物（表1）各2 μL、1.25 U DNA聚合酶，补加去离子水至50 μL。PCR 反应程序均为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃50 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃ 5 min。第二轮产物经试剂盒回收后待用。

1.7 PCR产物连接至T载体

将回收的第二轮PCR产物直接连接至T载体，连接体系包括 100～200 ng DNA 片段、1 μL T载体、5 μL 2×DNA连接酶缓冲液、1 μL T4DNA连接酶（2.5 U/μL），补加去离子水至10 μL。轻微混匀后，置10℃连接4 h以上。采用热冲击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α，并用氨苄西林（100 μg/mL）抗性平板筛选抗性克隆，PCR鉴定（鉴定引物对同第二轮PCR）阳性者测序。

1.8 引物延伸实验

将与VPA1027 mRNA互补的特异性引物（表1）的5′端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）进行放射性标记[13]，并将其退火到mRNA上，进而将其逆转录成cDNA。逆转录产物配伍测序条带进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，通过引物延伸条带的位置即可确定VPA1027转录起始位点。

2 结果

2.1 cDNA中无基因组DNA污染

总RNA用50 μL无核酸酶水溶解后，其浓度应在1000 ng/μL以上，且经琼脂糖凝胶电泳检测无降解后，方可满足下一步实验需要。总RNA经DNA-free试剂盒消化及连接Adapter后，直接逆转录成cDNA，而后通过RT-PCR方法验证cDNA中是否有DNA污染，结果见图1，以cDNA+和基因组DNA为模板时，均能扩增出同理论值大小一致的产物（231 bp），而以cDNA-和水为模板时，均不能扩增出条带，这说明cDNA中无基因组DNA污染，可用作5′-RACE实验的模板。

表1 本研究所用引物序列

2.2 靶基因的转录起始位点

采用巢式PCR扩增目的基因片段，如图2A所示，VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198均扩增出明亮的产物条带，但scrA条带拖尾现象较严重。将上述PCR产物直接与T载体连接，筛选鉴定阳性者送公司测序。图2B～F分别为VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的测序结果，分别与标准序列（DNA）比对，并根据Adapter序列，可以得出它们的转录起始位点分别为G（-103）、G（-70）、T（-205）、C（-129）和G（-238）（翻译起始位点为+1）。

2.3 引物延伸验证VPA1027的转录起始位点

图3为VPA1027的引物延伸实验结果，可以看出，若以翻译起始位点为+1，则VPA1027的转录起始位点为-103位的G，这与5′-RACE的结果一致，说明5′-RACE得到的转录起始位点是可靠的。

2.4 靶基因的启动子区序列

通过转录起始位点查询基因的核心启动子区，可以反向验证转录起始位点的正确性。图4为VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的启动子区序列。可以看出，scrG、cpsA和VPA0198均具有比较保守的-10（TATAAT）和-35（TTGACA）序列，这说明了其转录起始位点的可靠性；但VPA1027和scrA只有相对保守的-10序列，而-35序列保守性较差，这说明在生理条件下，它们的转录启动可能需要反式激活因子的辅助才能完成。

3 讨论

市售5′-RACE试剂盒是依据真核生物mRNA的帽子结构而设计的。无帽子结构的DNA片段、rRNA及tRNA的5′端磷酸基团极易被牛小肠碱性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIP）水解，而带帽子结构的mRNA则不受影响。但是，mRNA的帽子结构能被烟草酸焦磷酸酶（tobacco acid py⁃rophosphatase，TAP）水解，并留下5′端磷酸基团。因此，可以依次用CIP和TAP处理总RNA，再利用T4RNA连接酶将一个已知序列的寡核苷酸序列（Adapter）连接至mRNA的5′端磷酸基团上，并将其逆转录成cDNA，最后通过巢式PCR和DNA测序的方法即可确定mRNA的5′末端。由于原核生物的mRNA的无帽子结构，市售5′-RACE试剂盒并不能直接应用于原核生物mRNA的5′末端碱基的确定。我们在Ambion公司FirstChoice RLM-RACE试剂盒的基础上，抛弃CIP和TAP处理总RNA的步骤，利用Ambion公司的DNA-free试剂盒去除总RNA中污染的DNA，而后直接将Adapter接头连接至mRNA 5′末端，再将总RNA逆转录成cDNA，最后通过巢式PCR及测序的方法，成功定位了副溶血弧菌VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198的转录起始位点，并通过引物延伸的方法验证了VPA1027的转录起始位点。优化后的方案不仅操作更简单，而且应可适用于所有原核生物基因的转录起始位点定位。

图1 VP0820的RT-PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图

图2 第二轮PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图（A）及测序图谱（B～F）

图3 VPA1027的引物延伸实验结果

图4 靶基因启动子区序列

引物延伸和5′-RACE实验是寻找基因转录起始位点的两个常用方法，二者各有优缺点。引物延伸实验是一个逆转录的过程，其所得cDNA的量和mRNA的起始量成正比，因此它不仅可用来定位基因的转录起始位点，还可用于研究调控子对靶基因的调控关系[1-5,14-16]。然而，在转录起始位点搜寻的过程中，需要针对每个待研究的基因设计多条引物进行预实验，费时费力费财、成功率低，且易产生放射性污染，对实验者的健康也有损伤。5′-RACE实验虽然成功率高、避免了放射性同位素带来的不便，但是它所得到的转录起始位点受mRNA降解片段的影响，易出现假阳性，而且也不能用于研究调控子对靶基因的调控关系。基于此，最合理的方法是将5′-RACE实验和引物延伸实验紧密结合起来，首先利用5′-RACE实验找出靶基因的转录起始位点，再针对该位点设计特异性引物，利用引物延伸实验进行验证，从而可以大大提高引物延伸实验的成功率。

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