炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

刁立鹏，王艳春，万秀坤，陶好霞，袁盛凌，杨百亮，刘纯杰

1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.军事医学科学院 生物工程研究所，病原微生物与生物安全国家重点实验室，北京 100071

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽是一种自然疫源性疾病和人畜共患急性传染病，多发于牧区，在我国被列为乙类传染病。炭疽杆菌芽胞可以气溶胶的形式传播。炭疽呈全球性分布，在温带、卫生条件差的地区多发。动物主要由于摄入染菌野草和饲料或吸入染尘而感染发病。炭疽杆菌因其毒力强、危害大、芽胞存活时间长而成为潜在的生物武器[1]。

目前防治炭疽主要通过预防接种。我国和俄罗斯主要使用活芽胞苗，不加任何防腐剂和杀菌剂，为一次性接种。我国用的是A16R菌株，此菌株不含pXO2大质粒，不能形成荚膜，因此毒力大大减弱，通过皮肤划痕进行免疫接种，以活芽胞进入体内活菌数的多少作为免疫强弱的依据，它们在进入体内后还能够繁殖[2-3]。美国使用铝胶疫苗（AVA），是一种经氢氧化铝吸附和福尔马林处理的炭疽杆菌V770-NPI-R株的上清滤液，该菌株为产毒素、无荚膜、非蛋白酶解性炭疽杆菌[4]。上述2种疫苗均属于第一代炭疽疫苗，它们均存在一定的缺点。因此，研究新型炭疽疫苗具有重要意义。

目前炭疽疫苗研究的主要方向有两个，一是以减毒炭疽杆菌表达的保护性抗原（PA）rPA102或大肠杆菌表达的rPA结合适当佐剂作为疫苗，免疫方式为注射免疫；二是构建表达PA的活载体疫苗，如减毒炭疽杆菌[4]、枯草芽胞杆菌[5]、乳酸杆菌[6-7]、减毒沙门菌、减毒痘病毒载体等。活菌载体疫苗的优势在于其免疫后能够激发机体的细胞免疫应答，而且便于大量生产。

炭疽芽胞杆菌mntA基因与菌株的生长密切相关，它编码的MntA蛋白是一种可溶的ATP依赖的结合锰离子的转运载体蛋白，在体外培养和感染宿主的过程中都能表达，且MntA蛋白的表达不依赖于毒性质粒pXO1和pXO2。研究表明，mntA缺失突变会导致菌株毒力减弱，是一个新型炭疽毒力因子。因此，mntA缺失株有可能成为弱毒苗的候选株[8]。

本实验室已从我国现有疫苗株A16R（pXO1+pXO2-）制得AP422（pXO1-pXO2-），但进行豚鼠的动物实验后发现毒力仍较强。因此，我们拟对AP422株进一步减毒，敲除mntA基因，以便用于后续炭疽疫苗研究。

1 材料和方法

1.1 材料

炭疽杆菌AP422和质粒pMAD-spc、pHY-Cre均由本室保存；大肠杆菌SCS110感受态细胞为本室自制；大肠杆菌DH5α购自全式金公司；各种限制性内切酶为Thermo公司产品；DNA markerⅢ、1 kb lad⁃der购自中科瑞泰公司；T载体、pfu DNA聚合酶及其他PCR相关试剂和HRP显色试剂盒为TIANGEN生物产品；其他分子生物学试剂分别购自Promega、Ta⁃KaRa等公司；兔抗MntA的多抗血清为本实验室自制；HRP标记的鼠抗兔IgG抗体购自中杉金桥公司；PCR引物设计和序列测定由生物工程研究所中心仪器实验室完成。

1.2 打靶载体的构建

以AP422株基因组为模板设计引物。上游同源臂的上游引物为 uMntAF（5′-CGGGATCCGAACCA ACTGTTATGTC-3′），下游引物为 uMntAR（5′-ACG CGTCGACTTTTATCCTCCAATCA-3′）；下游同源臂的上游引物为 dMntAF（5′-CGACGCGTAATCTAGC TTGTGTAACTG-3′），下游引物为 dMntAR（5′-CGG AATTCCTGCTGCATAGTGAAG-3′）。PCR 条 件 ：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，5个循环；将退火温度改为54℃，其他条件不变，25个循环；72℃充分延伸5 min。

用pfu DNA聚合酶扩增出mntA基因上下游各约800 bp的片段，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切上游同源臂和pMAD-spc质粒，在22℃条件下连接，转化大肠杆菌DH5α，取连接正确的质粒测序；用MluⅠ和EcoRⅠ双酶切测序正确的质粒和下游同源臂后，与pMAD-spc质粒在22℃条件下连接，转化大肠杆菌DH5α，取连接正确的质粒测序。

1.3 mntA基因的敲除

活化培养AP422菌株，当D600nm值达0.5～0.6（约需2 h）时制备感受态细胞[9-11]；将质粒用Bio-Rad电转仪进行电转化，30℃孵育2.5 h，涂布于含壮观霉素（Spc）（300 μg/mL）的LB平板上，30℃过夜培养。

挑取克隆，42℃无抗传代，传5、6代后梯度稀释，分别涂在3块含Spc（300 μg/mL）和3块含红霉素（Em）（5 μg/mL）的LB平板上，将Spc平板于42℃培养，Em平板于30℃培养；当Em抗性平板上菌落生长较少时，从Spc抗性平板上挑取单菌落做点板实验，同时点在Em抗性平板和Spc抗性平板上；挑取在Em抗性平板上不生长且在Spc抗性平板上生长的单菌落进行培养[12]。

同前电击转入质粒pHY-Cre，30℃孵育2.5 h，将得到的重组菌在含Em（5 μg/mL）的LB培养基中于30℃下传2代，在无抗条件下于37℃传3代；在不含抗生素的平板上划线分离单菌落，然后进行抗生素抗性分析[13]。

1.4 重组菌的鉴定

1.4.1 PCR 以AP422和AP422ΔmntA菌株的基因组为模板，PCR扩增上下游同源臂的一部分和它们之间的基因。上游引物为5′-CTGTTGGAATTATT CTAGTTGTTGC-3′，下游引物为 5′-GGTAATGGGA TTTGGGAAGGTGATG-3′。PCR条件：94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，72℃充分延伸5 min。

1.4.2 Western印迹 对经PCR鉴定在基因水平发生重组的菌株制备全菌蛋白裂解液，用12%凝胶进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上，膜用5%脱脂奶粉于37℃封闭1 h，与抗MntA的多抗血清（1∶20 000）于37℃共孵育1 h，用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min，再与HRP标记的鼠抗兔IgG抗体（1∶5000）共孵育1 h，用PBST洗涤3次，每次5 min，最后将膜洗干净后用HRP显色试剂盒进行显色[14]。

1.5 突变株特性分析

1.5.1 生长曲线测定 将AP422和AP422ΔmntA菌株分别接种于5 mL脑心浸液（BHIG）液体培养基中，37℃培养12 h左右，取菌液100 μL接种于100 mL BHIG培养基中，37℃、250 r/min培养，每1 h测定一次D600nm值，以测定时间为横坐标、D600nm值为纵坐标，绘制被测菌在实验条件下的生长曲线。

1.5.2 芽胞形成能力分析 取2种菌的单克隆接种到5 mL BHIG培养基中，37℃、200 r/min培养过夜，取1 mL菌液，离心收集菌体，转接到装有5 mL预热到37℃的LB培养基中，37℃、250 r/min培养96 h以上，期间观察培养物的生长状态和芽胞形成情况。

1.5.3 2种菌生存能力的竞争实验 将AP422和AP422ΔmntA::spc分别接种于5 mL BHIG培养基中，37℃培养12 h，将培养物按1%的比例接种到5 mL新的BHIG培养基中培养12 h，各取500 μL菌液混合，取5 μL混合菌液接种到5 mL BHIG培养基中，37℃培养12 h；同时取100 μL混合菌液梯度稀释，各取100 μL涂布无抗平板和Spc抗性平板，于37℃培养16 h后计数菌落。在此基础上，按上述条件传代3次以上，按同样方法进行细菌计数分析。

2 结果

2.1 基因敲除载体的构建

以炭疽芽胞杆菌AP422的基因组为模板，用相应引物扩增基因打靶上下游同源臂（经测序鉴定正确），然后将上下游同源臂依次连接到质粒pMAD-spc上，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，质粒凝胶电泳表明重组质粒能切出约3 kb的目标条带（图1）。

2.2 mntA基因的敲除

将构建的打靶载体转化大肠杆菌SCS110，提取质粒后再转化炭疽杆菌AP422，通过一系列筛选得到带有Spc抗性标记的mntA基因缺失的重组菌AP422ΔmntA::spc，然后转入Cre重组酶表达质粒pHY-cre，Cre重组酶识别34 bp的部分反转重复的LoxP序列（ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT），通过分子内重组去掉spc抗性基因[15]，最终获得目的菌株AP422ΔmntA。

2.3 重组菌的鉴定

PCR结果见图2，AP422的扩增结果约为1500 bp，AP422ΔmntA的扩增结果约为500 bp，两者相差1000 bp，和mntA基因片段大小基本吻合，说明AP422的mntA基因已被敲除。将重组菌扩增得到的片段连接到T载体后测序，结果显示mntA基因已完全缺失，相应位点处只剩下一个LoxP位点，这就在基因水平上证实了mntA基因敲除成功。

炭疽芽胞杆菌为革兰阳性菌，细胞壁致密，经超声波破碎后，MntA蛋白可充分释放。MntA蛋白相对分子质量为35×103。以MntA蛋白抗血清为一抗的Western印迹结果如图3，AP422在35×103处有明显条带，说明有MntA蛋白表达，而AP422ΔmntA则无MntA蛋白表达，这就从蛋白水平上说明mntA基因被成功敲除。

2.4 生长特性鉴定结果

2.4.1 生长曲线 如图4，在本实验条件下，AP422的生长速度比AP422ΔmntA稍快，但区别不明显。

2.4.2 芽胞形成 将培养96 h的重组菌株进行芽胞染色（图5）。在实验条件下，突变株AP422ΔmntA形成芽胞的能力与对照AP422株基本一致，说明敲除mntA基因后没有影响菌株形成芽胞的能力，重组菌的这一特质也为后续研究芽胞疫苗载体打下了很好的实验基础。

图1 质粒的双酶切结果

图2 mntA敲除鉴定的PCR扩增结果

图3 重组菌的Western印迹鉴定结果

图4 菌株AP422和AP422ΔmntA的生长曲线

2.4.3 生长能力 根据实验设计，在Spc抗性平板上生长的菌落为AP422ΔmntA::spc，在无抗平板上生长的菌落为AP422ΔmntA::spc和AP422。无抗平板上的菌落数减去Spc抗性平板上的菌落数，即为AP422的菌落数。计算得出2种菌共培养之前的比例为1.30，培养到第1代时的比例为0.79，第2代时为0.05，第3代时为0.00003，培养到第4代时Spc抗性平板上基本没有菌落（图6）。这充分说明在体外培养条件下，AP422ΔmntA::spc的生长竞争能力要比AP422弱，这也在一个侧面表明mntA基因的突变使菌株的生存能力降低。。

图5 菌株AP422和AP422ΔmntA的芽胞形成情况

图6 菌株AP422和AP422ΔmntA共培养条件下的竞争实验

3 讨论

MntA蛋白是一种新型毒力因子，是可溶性的能与锰离子结合的脂蛋白，它是Lral/clusterⅨ家族的离子受体。炭疽杆菌mntA基因位于3个基因操纵子内，编码ABC转运受体。蛋白表达分析证实MntA蛋白在体内外均可表达。不像其他编码毒素的基因，mntA的表达不依赖于毒性质粒pXO1和pXO2。

在炭疽的致病机理中，炭疽芽胞杆菌的芽胞和宿主的吞噬细胞之间的相互作用是感染过程中很重要的一步。炭疽致病由宿主的吞噬细胞吸入炭疽芽胞开始，芽胞的发育和毒素的表达都在细胞中进行，最后炭疽芽胞杆菌裂解吞噬细胞，将繁殖体释放到细胞体外。研究发现[8]，在RAW264.7吞噬细胞系模型中，mntA突变株的生长和裂解吞噬细胞的速度变慢，这种缺陷可通过在培养基中加入适宜浓度的锰离子或通过mntA互补来恢复。

另有研究表明[8]，以豚鼠为动物模型，采用皮下注射的方式进行攻毒时，由炭疽芽胞杆菌Vollum株得到的mntA基因的缺失突变株较野生株的LD50从102提高到了8×105，提高幅度接近4个数量级，其毒力大大降低。这些结果都提示我们，mntA基因的缺失突变株可用于构建新型的减毒活芽胞疫苗。我们的结果也表明，mntA基因的缺失突变株与原始出发菌株共培养时其生长明显处于劣势，说明突变使菌株变得更安全，有望在研究新一代活芽胞疫苗中发挥重要作用。

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