表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

朱羿龙，李昌，刘存霞，杜寿文 ，王茂鹏，叶飞，谭鹏，邢彬，刘继，朱光泽，郭焱，金宁一

1.军事医学科学院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122；2.长春中医药大学，吉林 长春 130117

据世界卫生组织统计，2010年新感染人免疫缺陷病毒（HIV）的患者约270万人，而截至2010年底，约有3400万人携带HIV，所以迫切需要安全、有效的疫苗来应对HIV的蔓延。但是，由于抗原表位的时常突变、免疫原性弱，以及疫苗所诱导的抗原免疫反应时间短等原因，导致疫苗研发屡遭挫败[1-3]。对于其他病毒传染病，如麻疹、腮腺炎和风疹等，这种类似于免疫原性的问题是通过发展减毒疫苗株来解决的[4]，但是对于HIV和猴免疫缺陷病毒（SIV）而言，减毒活疫苗虽然很具有吸引力[5-6]，但却存在前病毒整合和某些情况下转变为野生毒株的风险[7]。相反，活病毒在作为HIV疫苗载体时具备了相当优秀的免疫原性[8-11]，其中以禽痘病毒为载体的HIV疫苗已开始临床应用，如Aventis Pasteur公司开发的重组金丝雀病毒载体ALVAC与gp120亚单位疫苗联合应用，并均可在受试者中检测到CTL反应[12]。

SIV与HIV-1具有一定的同源性，部分SIV毒株接种于亚洲猴子，会使其感染并产生类似艾滋病的症状[13]，因此，用SIV感染亚洲猴属作为模型被推荐替代HIV-1感染，使得SIV作为HIV的模式病毒在疫苗领域得到广泛应用。包膜糖蛋白（Env）在病毒进入宿主细胞的过程中起着至关重要的作用，我们以SIV env作为目的基因，以中国鸡痘病毒（fowlpox virus，FPV）疫苗株FPV282E4为载体，以EGFP为标记基因，采用挑斑方法筛选重组FPV，利用PCR、RT-PCR和Western印迹进行鉴定和遗传稳定性分析，最终获得一株稳定表达SIV Env蛋白的重组FPV，通过其所产生的免疫应答反应，可为HIV疫苗研究提供可资借鉴的数据。

1 材料和方法

1.1 材料

含有SIV env基因的质粒pVR-SIV env由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所冯霞博士惠赠；穿梭质粒 pTKET[14]、大肠杆菌 DH5α、FPV282E4株由本实验室保存；8～10日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，用于制备鸡胚成纤维细胞（CEF）。

1.2 重组质粒的构建

以pVR-SIV env为模板设计扩增SIV env的引物 F（5'-GCCACCATGGGATGCCTGGGAAAC-3'，添加KpnⅠ酶切位点及kozak序列）和R（5'-TCACTG CCTCAGCTTAGCCAG-3'，添加SalⅠ酶切位点）。反应条件：94℃变性 30 s；60℃退火 30 s，72℃延伸130 s，30个循环，72℃延伸10 min。将PCR产物连接到pMD18-T载体上，酶切鉴定正确后进行DNA测序。用KpnⅠ与SalⅠ双酶切T载体上测序正确的目的基因片段，插入FPV穿梭载体pTKET的相应位点，构建重组FPV质粒pTKET-SIV env（图1）。

1.3 FPV的重组、筛选和纯化

以5MOI（感染复数）的FPV282E4感染生长至80%融合的CEF，37℃、5%CO2条件下培养2～3 h，用QIAGEN公司的转染试剂Effectene Transfection Reagent将重组质粒转染至CEF中，继续培养72 h，在荧光显微镜下观察绿色荧光后，收取病变细胞并超声波破碎，将其接种于单层CEF中培养72 h，在荧光显微镜下挑取蚀斑，经超声波破碎，再次接种于单层CEF中，重复上述操作，待形成的细胞病变处无非绿色荧光病变细胞时，挑取噬斑进行扩增、鉴定。

1.4 重组FPV的整合与转录

将纯化的重组FPV以5MOI接种CEF，在37℃、5%CO2条件下培养72 h后收集细胞，提取感染细胞的总基因组和RNA，将RNA反转录成cDNA，以基因组和cDNA为模板，扩增SIV env、FPV-P4b（上游引物为5'-GGACGCGTATTGATTCACACCGTATTA CAGAGG-3'，下游引物为5'-CGCCCGGGTTCTCC TAATAAGTTACACCGTTTG-3'）、FPV-TK（上游引物为5'-GGACGCGTCAGCAGGTGCTAAACAACAA-3'，下游引物为5'-GGCTGCAGCGGTAGCTTAACG CCGAATA-3'）基因。反应条件：94℃变性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸130 s，30个循环；72℃延伸10 min。TK基因作为VAVC的一个常用插入位点，也用于FPV和其他禽痘病毒的重组位点[15-16]，因此选取TK基因作为重组FPV是否筛纯的鉴定指标。P4b基因存在于所有FPV中，通常将其用于FPV的特异性鉴定[17]。

1.5 重组FPV表达产物的检测

将纯化的重组FPV以5MOI接种CEF，在37℃、5%CO2条件下培养72 h后收集细胞，用裂解缓冲液RIPA裂解细胞，离心取上清，加入5×SDS-PAGE缓冲液，沸水浴10 min，经SDS-PAGE后转移到Im⁃mun-Blot PVDF 膜上，以兔抗 gp120/160（Mac293）（购自Eneyme公司）和鼠抗GAPDH抗体（购自碧云天公司）为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG（购自中杉金桥公司）和辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG（购自中杉金桥公司）为二抗进行抗体结合反应，利用ECL方法进行蛋白表达分析，设立GAPDH为内参。

图1 重组鸡痘病毒穿梭质粒的构建

1.6 遗传稳定性分析

将筛选纯化的重组FPV在CEF中连续传代20次，分别选取传代次数为1、5、10、15、20的感染病毒的细胞，观察荧光并提取其基因组、总RNA和总蛋白，利用PCR、RT-PCR、Western印迹检测SIV env基因在重组FPV中的遗传稳定性。

1.7 重组FPV在哺乳动物细胞中的表达

将纯化的重组FPV以5 MOI接种BHK21细胞，在37℃、5%CO2条件下培养72 h后，在荧光显微镜下观察细胞能否表达荧光。

2 结果

2.1 重组质粒的构建及鉴定

按照前述方法扩增SIV env基因，可获得2.1 kb左右的目的片段，将其分别连接到pMD18-T载体中，经KpnⅠ和SalⅠ双酶切，可切出2.1 kb左右的目的片段，表明扩增成功。经测序证明为目的基因序列（图略）。

2.2 重组FPV穿梭质粒pTKET-SIV env酶切鉴定

重组FPV穿梭质粒pTKET-SIV env经KpnⅠ和SalⅠ酶切，可看到2.1 kb左右的目的片段及4.8 kb左右的载体片段，表明质粒构建成功（图2）。

2.3 重组FPV的整合与转录鉴定结果

提取重组FPV感染CEF的基因组和总RNA，进行PCR和RT-PCR，结果见图3，重组FPV基因组和cDNA均可扩增出SIV env片段（2160 bp）、P4b片段（578 bp），证明目的基因已整合到重组FPV中并能进行转录。由图3还可以看出，重组FPV基因组未扩增TK基因，而野生型毒株可以扩增出TK特异性条带，说明重组FPV已经获得纯化。

2.4 重组FPV表达产物的检测结果

将重组FPV感染CEF的裂解液行SDS-PAGE和转膜后，分别与兔抗gp120/160、鼠抗GAPDH抗体和辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG反应，用ECL方法进行蛋白表达分析，以GAPDH为内参，结果见图4。重组病毒感染的细胞可检测出相对分子质量约120×103的SIV Env目的条带，而野生型FPV感染检测为阴性，用GAPDH抗体检测可见相对分子质量约40×103的目的条带，表明目的蛋白成功表达且具有抗原性。

2.5 遗传稳定性分析结果

将经挑斑纯化的重组FPV连续传代20次，分别取第1、5、10、15、20代病毒观察，可见每代均有荧光（图5）；提取基因组和总RNA进行PCR和RT-PCR检测SIV env基因，结果表明各代重组FPV均能扩增出2160 bp的目的片段（图6）；同时制备蛋白样品进行Western印迹，可见相对分子质量约120×103的特异性蛋白条带，而FPV检测为阴性（图7）。表明重组FPV传代20次内具有良好的遗传稳定性。

2.6 重组FPV在真核细胞中的表达情况

为了验证本研究构建的重组FPV能否在哺乳动物中表达外源蛋白，以5MOI病毒量感染BHK21细胞，72 h后观察，可以看到感染重组病毒的细胞有大量荧光表达，而感染野生毒株的对照细胞则无（图8），表明重组FPV能在哺乳动物细胞中表达。

3 讨论

图2 重组穿梭质粒的酶切鉴定

图3 重组FPV的PCR产物电泳图谱

图4 重组FPV表达产物的Western印迹鉴定

艾滋病在1981年突然出现，并在极短的时间内迅速蔓延，至今已造成约6000万人感染，而且新感染者人数正以每年260万持续增长[18]。艾滋病已成为世界上最具破坏性的传染病之一，虽然各国都在尽力研究抗艾滋病药物，企图阻止病毒在不同感染阶段时的复制，但由于HIV基因在治疗期间的突变，使得药物往往无法达到理想的治疗效果。因此，研制安全和有效的疫苗，是控制、消除艾滋病流行的主要措施，近年来研究者已逐步开始关注以病毒为载体的HIV疫苗。

FPV载体是应用较为广泛的禽痘病毒。鉴于禽痘病毒具有严格的胞浆复制、忠实表达外源蛋白、自然条件下只感染禽类、流产性感染哺乳动物且不产生感染性子代病毒粒子等特点，且其具有很大的外源基因容量，构建相对容易，因此以FPV为载体的重组疫苗已经应用于哺乳动物和禽类的研究中[19-22]。

SIV与HIV具有很高的同源性。由于SIV的遗传结构和生物特性与HIV非常相似，同时SIV猕猴动物模型与HIV患者有许多相似之处[23]，主要表现为身体消瘦、机会性感染及CD4+T淋巴细胞大量丢失，因此，SIV感染模型在目前最适于艾滋病发病机制及疫苗战略研究[24]。

图5 不同代次重组FPV的荧光分析

逆转录病毒的包膜糖蛋白在感染初期发挥着重要的作用，它涉及结合细胞膜和细胞表面受体使病毒融合进入细胞；在感染后期，Env在病毒装配的过程中也扮演重要角色，有证据表明包膜基质蛋白与Env在细胞内相互作用直接影响病毒粒子在极化上皮细胞的释放位置[25-26]，位于胞内区的Env能够相互作用，同时还会影响Env的掺入和感染力。此外，去除细胞质域能够增加被感染细胞表面Env的表达量和掺入病毒样颗粒以及Env融合活性[27]，同时Env还具备良好的免疫原性，能够有效刺激SIV特异性IFN-γ分泌细胞的产生和诱导较高水平的Env特异性反应[28]，能够产生高浓度的特异性抗体[29]，能够有效诱导产生CD4+T淋巴细胞增殖效应[30]。因此，Env作为有效抗原被广泛应用于疫苗研发。

本实验以SIV env为抗原基因，构建能稳定表达Env蛋白的重组FPV，并采用挑取噬斑的方法进行筛选，同时以EGFP基因为报告基因，使重组FPV在感染CEF后能特异性表达绿色荧光蛋白，由此大大提高重组病毒的检出率，又可避免用BrdU加压筛选导致基因突变的不利影响。用PCR、RT-PCT、Western印迹对重组FPV进行了鉴定和遗传稳定性分析，表明我们构建的重组FPV能同时表达SIV Gag和SIV Env，具备更广泛的免疫原性，且重组FPV能在BHK21细胞中大量表达，为其在哺乳动物中的应用及HIV疫苗研究提供了可资借鉴的数据。

图6 不同代次重组FPV的PCR产物电泳图谱

图7 不同代次重组FPV表达产物的Western印迹

图8 重组FPV在BHK21细胞中的表达

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