地皮菜细胞的分离纯化及形态发育研究

赵兰娟 于海峰

(齐鲁工业大学，山东济南 250353)

地皮菜学名普通念珠藻(Nostoc commune Vauch)，在分类学上属蓝藻门(Cyanophyta)，蓝藻纲(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostoccales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻属(Nostoc)［1］中的 Nostoccommune Vauch，是念珠藻中的群体型(Colony)。一般地皮菜藻体呈片状，为肉眼可见的胶状扩展群体，藻丝由50～170个营养细胞和异形胞组成，在胶鞘内无规则地排列，相互缠绕而成平时所见的原植体。

地皮菜可食用，并有一定的药用价值，富含蛋白质、脂肪酸、粗纤维、总糖矿物质、维生素，微量元素等营养成分［2－5］，还有特殊的活性成分藻蓝蛋白、胞外多糖等，是人们的席上佳肴和健康饮品，并可入药，《本草纲目》、《中国药典》中均有记载，如果科学合理的开发地皮菜，则具有广阔的应用前景［6－9］。近年来，由于环境的污染及过度开采，使得该资源逐渐减少，面临庞大的市场需求，要想扩大地皮菜的产量，首先必须获得纯净的优质藻种。分离地皮菜藻种的方法有多种［10］，本实验以地皮菜为实验材料，从原植体处理出发，研究了在不同处理条件下，对地皮菜进行分离纯化的影响，同时进行显微观察，为研究地皮菜的形态发育提供了依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

野生地皮菜取自河南桐柏山的沙质土壤上。挑选叶片比较厚，色泽比较亮丽呈墨绿色的原植体，除去杂草，用清水洗净干燥后保存，待下一步实验使用。BG11培养基和2%琼脂固化的BG11培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 地皮菜处理条件的筛选

参考常用原植体处理时常用的方法［11－12］的基础上，选择H2O2处理、乙醇处理、紫外处理三个因素，首先进行单因素实验，筛选出最佳的处理方式，然后进行多因素的复合实验。

1.2.2 培养方法

将处理过的地皮菜在超净工作台下，用研磨器碾碎，制成藻悬液，BG11培养基培养。将接种的三角瓶和平板置于25℃、1500lx光照下静置培养。

1.2.3 原植体处理实验设计

将清洗干净的地皮菜，分别利用不同的单因素处理，分别筛选出最佳的单因素条件，H2O2浓度设置1%、3%、5%、7%、9%5个水平，分别处理30s;乙醇浓度设置65%、75%、85%、95%4个水平，分别处理40s;在紫外照射强度为800uW/cm2条件下，紫外处理时间设置 10min、15min、20min、25min、30min5个水平分别处理地皮菜，进行分离地皮菜藻种，依次筛选出最佳的条件。在筛选出的条件下，分别设置不同的因素水平，确定最佳H2O2处理时间(10s、30s、50s、70s、90s)、乙醇处理时间(20s、40s、60s、80s、100s)、紫外强度 (200uW/cm2、400uW/cm2、600uW/cm2、800uW/cm2、1000uW/cm2)。

确定出最佳的单因素的条件下，分别在不同的H2O2浓度、H2O2处理时间、乙醇浓度、乙醇处理时间、紫外处理时间、紫外强度的条件下，利用不同因素复合处理，在不同因素共同的作用下，确定原植体的最佳处理条件。

1.2.4 平板培养分离藻种

由于在分离藻种的过程中，杂藻的细胞数量随培养时间的延长逐天增加，成为优势群体，其中小球藻和栅藻最为常见，因此，需要不断地进行分离纯化培养。

利用筛选出的最佳条件，将处理的原植体，用匀浆器研磨［13］，进行液体培养数天后，接着用无菌吸量管吸取培养液1ml，进行梯度稀释，无菌条件下每个平板接种1ml，涂布棒涂匀，每个实验组设置3个重复，用封口膜密封置于培养条件为25℃，光照强度为1500lx下静置培养10～15d，直至在培养基表面长出可见的微群体。

平板培养数天后，会出现形态不同的单菌落，镜检，挑取念珠状的菌落转接到BG11液体培养基中培养，多次进行固体BG－11培养基培养和液体转接纯化得到大量藻丝体。

2 结果与分析

2.1 地皮菜单因素处理结果

2.1.1 H2O2浓度处理及作用时间对分离效果的影响

通过H2O2不同浓度的处理，BG11液体培养基培养数天，每天镜检观察，并进行拍照。15d后，发现由几个细胞组成的藻殖段开始发育，藻丝不规则地分布，念珠状细胞组成的藻丝长短不一，排列形状各异，藻丝表面覆盖着大量的胶质物。其中1%H2O2处理分离效果明显(图1(a))，其次3%。

图1 单因素处理分离的地皮菜藻种

在1%H2O2的条件下，不同H2O2处理时间对不同藻类的作用效果也用很大的差别，由(图1(b))可知，其中30s条件下，可分离获得地皮菜藻种;其次是50s，处理时间过短和过长，原植体解体的程度也不同，细胞生长状态各异，念珠状不明显。

2.1.2 乙醇浓度处理及作用时间对分离效果的影响

不同浓度的乙醇，除菌效果差别很大，其中75%的灭菌效果较好(如图1(c))，能够除去原植体表面的大部分细菌，可以分离出念珠状发藻殖段，浓度过低或过高，都不利于原植体的表面灭菌。

经过75%乙醇，不同时间处理的地皮菜，除菌效果也有明显的差异，40s就可除去原植体表面的大部分细菌(图1(d))，分离获得念珠状藻丝体。

2.1.3 紫外处理时间及作用强度对分离效果的影响

利用紫外进行表面灭菌，不同时间处理后，连续培养，镜检观察，在第4d，经过20min的紫外处理的样品，分离得到念珠状明显的藻体(图(e));经过10min处理的样品，原质体解体程度较小，仅出现少量的藻殖段;经过30min处理的样品，处理的效果和10min处理的效果类似。

距离灯管越近，紫外照射强度越大，当距离灯管强度是800uW/cm2时，可分离出地皮菜藻种(图1(f))，分离出的地皮菜生长状态较好;当照射强度较低时，多种藻类缠结在一起，分离效果不明显，当照射强度较高时，念珠状的藻丝体表现出生长抑制的状态。

2.2 复合因素处理原植体对分离效果的影响

通过单因素实验，筛选出最佳H2O2浓度、H2O2作用时间、乙醇浓度、乙醇作用时间、紫外处理时间、紫外强度，以一个因素为变量，进行多因素复合实验，处理原植体，于BG11培养基培养，每天连续镜检观察，在不同因素同时处理时，分离纯化地皮菜藻种。

表1 地皮菜原植体处理水平表

经过多因素复合处理实验，发现在经过1%H2O2、H2O2处理时间30s、乙醇浓度75%、乙醇处理时间为 40s、紫外处理时间 10min、紫外强度 800 uW/cm2处理的原植体，经过液体BG11培养数天，镜检观察，可分离获得生长状态良好的地皮菜藻种。随着培养时间的延长，其他条件下，杂藻的不断生长，影响了地皮菜藻丝体的生长。

图2 复合因素处理分离的地皮菜藻种

2.3 地皮菜的发育研究

在分离培养的过程中，通过培养观察，发现细胞存在不同的繁殖方式及形态发育，常见的地皮菜的繁殖方式:

1)二分裂是细胞分裂的最简单也是最常见的分裂方式(图3(B、C))，这种繁殖方式对适应环境起到重要的作用，可以使藻丝的长度迅速增加;

2)在藻种分离的过程中，藻殖段是一种常见的短而直的可移动的藻丝，细胞的个体小，形态上比较短，与营养藻丝容易区分，藻殖段的分化，是由一系列的调控机制作用形成的［14－15］;

3)在环境不利的条件下，营养细胞可以转化发育形成厚壁孢子，在藻种分离的过程中，不同阶段观察到的厚壁孢子数量有明显的差别，条件适宜时，萌发生长形成新个体;

4)营养细胞在缺氮的条件下，还可以转变形成异形胞(图3(D))，特殊条件下，也可以产生内生孢子，繁殖发育成新的藻丝，异形胞有间生和端生两种存在方式，藻丝可在异形胞处断裂形成藻殖段，异形胞的主要功能是在恶劣条件下，起到保存物种的作用;

5)在比较潮湿的环境中，地木耳藻体可以进行出芽繁殖，藻体表面形成许多芽状小突起，随着小突起逐渐变大，释放藻丝体，脱离母体，继续发育成新的个体。

地皮菜的形态发育阶段:

1)藻殖段阶段，从由几个细胞组成的藻殖段开始发育，由于细胞具有伪空泡，藻殖移动范围很大;

2)小群体阶段，当藻殖段到达一定长度后，藻丝的周围可逐渐形成群体胶鞘，细胞在胶鞘内分裂，使得藻丝在胶鞘内发生弯曲变形，这个阶段，藻丝生长最为迅速，并且异性胞开始分化出现，藻丝在异性胞之间断裂或死亡的营养细胞处断裂，亦可形成藻殖段;

3)大群体阶段，随着藻丝的强烈扭曲，群体不断扩大，形成肉眼可见的群体，这个阶段群体的内部和色素发生很大变化，细胞处于最敏感的时期，在这个阶段开始，地皮菜的形态因环境的不同可形成不同的形态。

图3 地皮菜的发育研究

3 结论

分离藻种的方法很多，本实验从处理原植体出发，在不同因素不同条件处理下，无论是念珠状细胞的生长状态还是原植体的解体程度等各方面的因素，分离藻种的效果不同，再进一步的分离涂布和液体转接培养，可获得较纯的藻种，在分离的过程中，杂藻的污染成为主要的影响因素。

通过对地皮菜的形态观察，发现在不同的原植体处理和环境条件下，地皮菜可形成不同的分裂方式和细胞形态，为了解地皮菜的发育生活史提供依据。

［1］王勋陵，王静，刘思清.地木耳的超显微结构观察［J］.植物学报，1985，29(5):469－474.

［2］王云，彭友林，黄建韶，等.地木耳资源的开发利用［J］.特种经济动植物，2002(4):40.

［3］ROBERTO D P，CECILIA F，MARIA C.Morphological and biochemical characterization of the exocellular investments of polysaccharide－producing Nostoc strains from the Pasteur Culture Collection［J］.World J Microbiol Biotechnol，2000，16:655 －661.

［4］HOLLY E J，STEVEN R K，SANDRA A B.Cyanobacteria(Nostoc commune)used as a dietary item in the Peruvian highlands produce the neurotoxic amino acid BMAA［J］.J Ethnopharmacol，2008，118:159 －165.

［5］Kobayashi A，Kajiyama S，Inawaka K，et a1.Nostodiene A，a novel mitotic spindle poison from a blue－greenalga Nostoc commune Z ［J］.Natur for Sch，1994，49:464 －470.

［6］纪丽莲，李文谦，赵玉萍.盱眙地皮菜的液体培养研究［J］.江苏农业科学，2007(1):159－161.

［7］王弋博，李三相，施文甫，等.地木耳提取物水溶液对花卉营养生长及开花的影响［J］.西北植物学报，2004，24(2):3l1－315.

［8］王长祥.地皮菜中6种元素的含量分析［J］.微量元素与健康研究，2010，27(1):50 －51.

［9］思小燕，吴启勋.青海不同产地地木耳中微量元素的主因子分析和聚类分析［J］.佳木斯大学学报:自然科学版，2009，27(2):309－311.

［10］贺继峰.普通念珠藻的固体培养研究［D］.山西大学硕士学位论文，2012.

［11］赵丽娟，王秀娟，周成旭，等.宁波地木耳人工培养条件的研究［J］.宁波大学学报，2011(24):19－23.

［12］纪丽莲，李文谦，赵玉萍.盱眙地皮菜的液体培养研究［J］.江苏农业科学.2007(1):159－161.

［13］苏振宏，王芳，尹美珍.发状念珠藻的分离纯化及人工培养条件研究［J］.黄石理工学院学报，2011(27):37－40.

［14］钟泽璞，施定基.丝状体蓝藻藻殖段的分化及其调节机制［J］.植物学通报，2000，17(3):204 －210.

［15］李敦海，宋立荣，刘永定.念珠藻葛仙米的藻殖段分化——信号转导参与过程的初歩研究［J］.植物学通报，2002，19(3):328－335.