酒精性脂肪肝大鼠肠道屏障功能变化及化滞柔肝颗粒的保护作用*

李晓梅，孙宝存，刘 奋，罗涟荣，宋洪运，赵志全，姚景春

酒精性肝病是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。在疾病初期，通常表现为酒精性脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。国内外已有文献报道有关酒精性肝病的肠道屏障功能（intestinal barrier function，IBF）变化[1]。IBF在酒精性肝病发病中的作用机制已经得到证实。Keshanarzian et al[2]报道，酒精可致IBF障碍，使小肠黏膜通透性增加，肠源性内毒素渗漏形成肠源性内毒素血症（Intestinal endotoxemia，IETM），对肝脏造成“二次打击”，加重肝损伤。我们观察了酒精性脂肪肝大鼠肠道屏障功能及肝组织病理学改变，以及化滞柔肝颗粒的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量为250～350 g（鲁南制药集团股份有限公司实验动物中心提供）；56%（V/V）北京红星二锅头白酒为市售产品；乳果糖口服溶液为荷兰苏威制药生产；甘露醇为山东辰欣药业股份有限公司产品；护肝片为黑龙江葵花药业股份有限公司提供；化滞柔肝颗粒（由茵陈、决明子、大黄、泽泻、猪苓、山楂、苍术、白术等16味中药组方而成）由山东新时代药业有限公司提供。

1.2 模型制备 大鼠适应性饲养一周后，随机将60只大鼠分为正常对照组（A组）、模型组（B组）、小剂量化滞柔肝组（C组，1.1 g·kg-1d-1）、中剂量化滞柔肝组（D组，2.2 g·kg-1d-1）、大剂量化滞柔肝组（E组，4.4 g·kg-1d-1）和护肝片阳性对照组（F组，0.4 g·kg-1d-1），每组10只。A组用蒸馏水灌胃，其余组上午给予56%红星二锅头10 ml·kg-1d-1灌胃，下午给予相应的药物灌胃，持续5周。于最后一次灌胃后24 h，用2%戊巴比妥钠40 mg·kg-1经尾静脉注射麻醉，心脏采血3 ml，用于血生化检测；在无菌条件下打开腹腔，暴露内脏，取出肝脏和肠系膜淋巴结复合体（mesenteric lymph node complex，MLN），称其质量后用于肠道细菌移位（bacterial translocation，BT）的检测；取末端回肠行组织病理学检查。

1.3 肠道BT的检测 取肠系膜根部淋巴结数枚，约500 mg，加2 ml生理盐水，剪碎，迅速放入准备好的无菌肉汤试管中培养24 h，然后各吸取200μl肉汤，分别接种在BBC血平板培养基上，置于37℃培养箱内培养24 h，观察细菌培养结果，计算各组细菌移位率（移位阳性动物个数/该组动物总数×100%）。按照国际通用标准，菌落数>100菌落/克淋巴结组织即为细菌阳性。

1.4 肠道通透性的检测 在造模四周时，即第28天早晨给予所有试验大鼠乳果糖和甘露醇混合液灌胃一次，每份灌胃样本为乳果糖（100 mg）和甘露醇（50 mg）溶于2 ml生理盐水中，利用代谢笼收集6 h尿液，-20℃保存。用高效液相色谱仪（美国Waters e2695-2414）测定尿中乳果糖和甘露醇浓度，计算各自的排出率，以乳果糖（lactulose，L）/甘露醇（mannitol，M）排出率（L/M%）表示肠道通透性。

1.5 血生化的检测 采用深圳迈瑞生物医疗股份有限公司生产的BS-200全自动生化分析仪测定。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以（±s）表示，采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠肠道BT、L/M及肝质量指数的变化 与对照组相比，模型组动物肠道BT显著升高（P<0.01），L/M比值升高（P<0.05），肝质量指数显著升高（P<0.001）；与模型组相比，小剂量化滞柔肝组肠道BT有下降趋势，L/M比值下降（P<0.05），肝质量指数下降（P<0.05）；中剂量化滞柔肝组及大剂量化滞柔肝组肠道BT均下降（P<0.05），L/M比值和肝质量指数显著低于模型组（P<0.01）；阳性对照组肠道BT及L/M比值降低（P<0.05），肝质量指数显著低于模型组（P<0.01），见表1。

2.2 各实验组大鼠血生化指标的变化 与对照组相比，模型组动物血ALT、AST有升高趋势，但无统计学差异，ALP水平显著升高（P<0.05）；小剂量化滞柔肝组ALT、AST和ALP水平与模型组相比均有下降趋势，但无统计学差异；与模型组相比，中剂量化滞柔肝组和大剂量化滞柔肝组ALT、AST和ALP水平均显著降低（P<0.05）。各试验组大鼠血T-BIL水平均无显著性变化，见表2。

表1 各组大鼠肠道BT、L/M和肝质量指数（±s）的比较

表1 各组大鼠肠道BT、L/M和肝质量指数（±s）的比较

与 B组比，①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

肝质量指数（%）A组 1013.6±0.4③B组 1074.3±0.6 C组 933.8±0.3①D组 1013.7±0.3②E组 923.6±0.2②只数 细菌移位BT（%）10.0②70.033.310.0①22.2①L/M（%）0.23±0.07①0.38±0.20.27±0.06①0.22±0.2②0.18±0.07②

表2 各组大鼠血生化指标（±s）的比较

表2 各组大鼠血生化指标（±s）的比较

与B组比，①P<0.05

ALT（U/L）AST（U/L）ALP（IU/L）T-BIL（μmol/L）A组 48.7±2.7135.4±18.7306.4±67.1① 2.5±0.9 B组 54.1±17.2163.2±67.5427.1±126.62.5±0.7 C组 44.0±8.4128.8±41.6439.4±62.91.8±0.9 D组 39.8±5.0① 113.4±38.3① 334.4±47.6① 2.5±0.6 E组 40.8±5.6① 111.2±28.9① 350.2±112.2① 2.6±0.7 F组 50.4±15.4142.8±42.9268.2±63.5② 2.0±0.6

2.3 肝组织病理学表现变化 大体观察，对照组大鼠肝脏色泽鲜红、边缘锐利、质地柔韧而富有弹性，被膜光泽；模型组大鼠肝脏外观呈弥漫性肿大，边缘稍钝，有油腻感，压迫时可出现凹陷，表面色泽较苍白,部分略带灰黄色。切面呈淡黄色，甚至苍白色；小剂量化滞柔肝组及护肝片组肝脏表面颜色略黄，触之有油腻感，质地较柔韧；中剂量及大剂量组肝脏表面颜色略黄，质地较柔韧，弹性可。

在光镜下，对照组动物肝脏肝小叶及肝细胞结构正常，内无脂肪变性、炎症和坏死，肝细胞索排列整齐（图1）；模型组肝小叶结构紊乱，肝小叶Ⅰ、Ⅱ带区内见肝细胞胞浆疏松（部分呈气球样变）、偶见肝细胞灶性坏死并伴少量淋巴细胞浸润，肝小叶Ⅱ带区还可见肝细胞呈小空泡性变（轻度脂肪变），个别动物肝窦扩张淤血（图2）；小剂量化滞柔肝组动物肝板结构正常，肝细胞内充满大小不一的脂滴。细胞核被挤向一边。肝细胞的脂肪变性呈弥漫性改变（图3）；中剂量化滞柔肝组动物肝脏肝板结构正常，肝细胞内充满大小不一的脂滴。肝细胞脂肪变性呈小片状改变（图4）；大剂量化滞柔肝组肝板结构正常，肝细胞内充满大小不一的脂滴。肝细胞脂肪变性呈点灶状改变（图5）；护肝片组动物肝脏肝板结构正常，肝细胞内充满小脂滴。肝细胞脂肪变性呈小片状改变（图6）。

图1 对照组大鼠肝组织病理学表现 结构正常（HE，400×）

图2 酒精性脂肪肝大鼠肝组织病理学表现 肝细胞浊肿（HE，400×）

图3 小剂量化滞柔肝组大鼠肝组织病理学表现 肝细胞浊肿，轻度脂肪变（HE，400×）

图4 中剂量化滞柔肝组大鼠肝组织病理学表现 肝细胞轻度脂肪变（HE，400×）

图5 大剂量化滞柔肝组大鼠肝组织病理学表现 肝细胞灶性脂肪变（HE，400×）

图6 护肝片组大鼠肝组织病理学表现 肝细胞轻度脂肪变（HE，400×）

2.4 回肠组织病理学表现 大体观察各组大鼠回肠黏膜色泽正常，均未见糜烂、出血及溃疡等改变。在光镜下对各组末端回肠黏膜损伤程度进行分析，均未见黏膜损伤、炎症及充血等改变。

3 讨论

酒精性脂肪肝病位在肝，有关中医药防治酒精性脂肪肝的研究大多围绕“肝脏”这一“本脏”的形态和功能变化而展开[3，4]。鉴于中医学理论脏腑联系的整体观及中药复方的多途径药理作用[5]，特别是近年来现代医学对酒精性脂肪肝病理机制的不断深入研究所揭示的“脏腑联系”[6]，所以在临床治疗和研究过程中，需要重视相关脏腑的变化及其意义。本试验结果表明酒精性脂肪肝大鼠肠道通透性显著增加，这是因为乙醇通过激活肌球蛋白轻链激酶使细胞间紧密连接发生改变，乙醇代谢过程中产生的乙醛通过抑制酪氨酸磷酸酯酶，引起紧密连接蛋白酪氨酸磷酸化，进而重组细胞间隙处的紧密连接蛋白，破坏细胞间紧密连接，增加细胞通透性[7]。本实验结果表明，化滞柔肝颗粒可以显著改善酒精性脂肪肝大鼠的肠道通透性，表明化滞柔肝颗粒可以抑制酒精引起的肠通透性增加，减轻内毒素渗漏，从而减轻脂肪肝和肝损伤。

研究发现，酒精性脂肪肝患者中存在小肠细菌过度生长[8，9]。嗜酒者胃酸减少，胃液pH值增高，杀菌作用减弱，使细菌进入小肠过多，从而引起肠道细菌，尤其是革兰氏阴性杆菌过度生长[10，11]。本实验结果表明酒精性脂肪肝大鼠肠道移位率明显高于正常组，这与其它研究发现一致。中剂量和大剂量化滞柔肝药物可以显著降低酒精性脂肪肝大鼠肠道细菌移位率。

酒精性脂肪肝患者血ALT和AST可轻微异常[12]。本实验结果显示酒精性脂肪肝模型大鼠血ALT和AST水平高于正常组，但无统计学差异，与临床一致。化滞柔肝颗粒可以显著降低大鼠血清ALT和AST水平。

中医对于酒精性肝病有伤酒、胁痛、酒癖、酒疸和酒臌等病名，认为饮酒为外因，而素体禀赋不足、脾胃虚弱为内因，健脾等调理脾胃运化功能的治疗方法是临床治疗酒精性肝病的基本治法治则。嗜酒者损伤脾胃，中医学认为，脾主运化水谷精微，主升清，为后天之本；小肠主盛化物，泌别清浊。其“泌别”功能与“肠道屏障”，“清浊”与“菌群内毒素”可谓具高度一致性[13～16]。化滞柔肝颗粒中的苍术、白术、陈皮均有补裨益胃、祛湿化浊的作用。

本实验证实化滞柔肝颗粒通过改善肠道屏障功能，对酒精所致的酒精性脂肪肝大鼠肝脏炎症及主要诱发因素均有一定的改善作用。因此，化滞柔肝颗粒对于预防或治疗酒精性脂肪肝可能具有一定的价值，值得进行临床验证。

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