体外产气法研究植物精油对水牛瘤胃发酵和甲烷生成的影响

黄江丽，王东升，张志红，张国华，田晓娟，谭胤静，付 明，丁建南

(江西省科学院生物资源研究所，330096,南昌)

体外产气法研究植物精油对水牛瘤胃发酵和甲烷生成的影响

黄江丽，王东升，张志红，张国华，田晓娟，谭胤静，付 明，丁建南*

(江西省科学院生物资源研究所，330096,南昌)

为探讨植物精油对水牛瘤胃体外发酵的影响，本研究采用体外产气法初步研究了不同植物油对水牛瘤胃发酵过程中甲烷和二氧化碳生成及微生物蛋白和pH的影响。与对照组相比结果表明:1)在相同添加浓度下，桂皮油在发酵过程中基本抑制了甲烷生成(P<0.05)，也显著降低了二氧化碳产量(P<0.05)，微生物蛋白含量减少了15%;2)薄荷油在发酵12 h、24 h均显著抑制甲烷生成(P<0.05)，对二氧化碳产量稍有降低，但差异不显著；在发酵36 h，抑制甲烷效果不明显，二氧化碳反而显著降低(P<0.05)。微生物蛋白含量则减少了12.8%;3)生姜油和丁香油的抑制甲烷效果不明显，只在发酵12 h，有部分降甲烷效果，之后反而促进了甲烷生成;4)5种精油中，只有辣椒油处理组发酵液pH显著降低，其它对pH值影响不大，但辣椒油无抑制甲烷效果。

植物精油；瘤胃；体外产气法；甲烷生成

0 引言

反刍动物瘤胃内产生的甲烷是有机物发酵的必然产物。据报道，反刍动物产生甲烷会造成总能量损失2%～12%[1]。同时，甲烷是造成温室效应的主要气体之一。所以，抑制反刍动物甲烷的产生对经济和环境都有重要的意义。在反刍动物中，牛体格大，采食量大，饲养数量多，因此所产生的甲烷的总量是不可低估的。目前，抗生素离子载体等已经成功地用于降低瘤胃中能量和蛋白质的损失。由于抗生素在乳和肉中残留及其对人类健康影响的风险，公众越来越重视抗生素等促生长剂在畜禽生产中使用[2]。因此，开发天然的瘤胃调控剂对提高反刍动物生产性能和保护环境均有重大意义。

植物精油是从植物中萃取的芳香物质，是植物的次生代谢产物，具有天然无耐药性、毒副作用小等优势，近年来被广泛应用于反刍动物瘤胃调控研究中。本研究通过体外产气试验评价不同植物精油对瘤胃甲烷产量和发酵参数的影响，旨在寻找经济有效的瘤胃甲烷调控精油种类，为进一步研制反刍家畜降甲烷微生态生长促进剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

天然提取的植物挥发油全部购自江西吉安盛大香料油有限公司，提取方法为水蒸汽蒸馏法，4 ℃冰箱保存。莫能菌素(有效成分含量为40%)购自江西南昌兽医防疫站。

1.2体外瘤胃发酵实验设计

实验设负对照组(未添加组)和正对照组(添加60 mg/L莫能菌素组)。各精油浓度统一用量为500 mg/L,每个处理设5个重复。分别在12 h、24 h、36 h测定CH4和CO2含量，发酵结束后测定发酵液pH值，并把发酵液保存在4 ℃冰箱，用于微生物蛋白含量测定。

1.3体外培养

采用Maur icio[3]等的压力读取式体外产气系统进行体外瘤胃发酵培养。瘤胃液取自江西南昌县小兰工业园屠宰场。在试验当天晨饲前抽取水牛瘤胃液，4层纱布过滤至预热处理后的收集瓶，39 ℃水浴保温,冲入CO2厌氧备用。在体外培养前, 将发酵底物(稻草粉、玉米粉和黄豆粉按照2:1:0.3比例)及相应量的植物精油预先称入100 mL产气瓶中，然后准确抽取40 mL人工唾液。将产气瓶用CO2饱和后密封并于39 ℃恒温培养箱内过夜后吸取10 mL瘤胃液于产气瓶中，混匀，产气瓶置于39 ℃恒温培养箱中培养。厌氧人工瘤胃缓冲液的配制按Menke[4]等的方法配制, 配方如下：在520.2 mL蒸馏水中依次加入208.1 mL缓冲溶液( B) 、208.11 mL常量元素溶液(C)、0.1 mL微量元素溶液(A)、1.0 mL刃天青指示剂(D)，62.4 mL还原剂溶液(E)，通入CO2气体使其饱和，直至溶液由淡蓝色转变为无色。

A，微量元素溶液：13.2 g CaCl2·2H2O+10.0 g MnCl2·4H2O+1.0 g CoCl2·6H2O+8.0 g FeCl3·6H2O,加蒸馏水溶解,定容至100 mL；

B，缓冲溶液：4.0 g NH4HCO3+35.0 g NaHCO3,加蒸馏水溶解定容至1 000 mL；

C，常量元素溶液：9.45 g Na2HPO4·12H2O+6.20 g KH2PO4+0.60 g MgSO4·7H2O，加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；

D，0.1%(W/V) 的刃天青溶液，100 mg刃天青溶解于100 mL蒸馏水；

E，还原剂溶液(现配现用)：625 mg Na2S·9H2O+4.0 mL 1 mol/L NaOH+95 mL蒸馏水。

1.4测定指标及方法

CH4和CO2含量测定采用Gasboard 3 200L便携红外沼气分析仪(武汉四方光电科技有限公司)，发酵液pH值用梅特勒-托利多酸度计直接测定，菌体蛋白的测定采用Makkar和Becker[5](1999),Zinn和Owens[6](1986)的试验原理和试验方法，用嘌呤法测定体外菌体蛋白产量。

1.5统计分析

试验数据采用EXCEL2003整理，运用SPSS18统计软件进行统计分析，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1植物精油对甲烷和二氧化碳的影响

植物精油对甲烷影响总结于表1。表1是发酵时间12 h、24 h、36 h各处理的甲烷变化情况。从表1可以看出，发酵12 h时，桂皮油完全抑制了甲烷生成，比正对照组即莫能菌素组效果显著(P<0.05)。与负对照比，抑制甲烷效果好的依次还有薄荷油(P<0.05)、丁香油、生姜油，但均没有正对照组效果显著。辣椒油则稍微促进甲烷的生成。发酵24 h时，桂皮油处理组依然不产甲烷，说明桂皮油完全抑制了甲烷生成。而生姜油、丁香油则开始促进甲烷生成。薄荷油处理组产甲烷量与12 h一致，但效果超过了正对照组，说明抑制效果稳定。发酵36 h时，桂皮油处理组开始产少量甲烷，而其它处理组产甲烷量均降低。与正负对照组比，桂皮油抑制效果显著，薄荷油则稍微比负对照组产甲烷量少，而辣椒油、生姜油和丁香油则均比负对照组产甲烷量稍高。

表1 不同时间点各处理的CH4(%)变化情况

*均值差值在0.05级别上较显著。

综上，桂皮油在发酵过程中完全抑制了甲烷生成，发酵36 h前，产气量均为0，发酵到36 h时才产极少量的气。薄荷油抑制甲烷效果显著，只是随着发酵时间延长，薄荷油的消耗，抑制作用也相应降低。生姜油和丁香油则只在发酵12 h时有抑制效果。图1是发酵12 h时各处理的产甲烷量均值图。从图1可明显看出桂皮油的抑制效果，其它除辣椒油组外各处理组均不同程度地抑制了甲烷生成。

表2为植物精油对CO2产量的影响。从表2中可以看出，发酵12 h和24 h时，与对照相比只有桂皮油处理组显著降低了CO2产量(P<0.05)，可能与其完全抑制甲烷产生，也抑制其它微生物生长有关。发酵36 h时，薄荷油、丁香油处理组显著降低CO2产量(P<0.05)，而桂皮油处理组反而差异不显著，可能随着桂皮油的消耗，除产甲烷菌外利于发酵的微生物差不多恢复正常水平。

图1 发酵12 h时各处理产甲烷均值图

表2 不同时间点各处理的CO2(%)变化情况

*均值差值在0.05级别上较显著。

2.2植物精油对发酵液MCP和pH的影响

pH是一项反映瘤胃内环境稳态的指标。本实验取发酵36 h后的发酵液测定pH值和MCP含量。图2为植物精油对发酵液MCP含量影响图，植物精油对发酵体系pH的影响总结于表3。由图2可以看出，各处理MCP含量都低于正负对照组，与对正对照组相比以生姜油含量最低(降低20%)。其次为桂皮油(降低15%)，辣椒油和薄荷油(降低12.8%)，丁香油(降低10%)。其中辣椒油、薄荷油、丁香油处理组的MCP含量接近正对照组。而根据表3，与正对照比较，只有辣椒油处理组pH差异显著(P<0.05)，其它各处理pH差异不显著。

图2 植物精油对发酵液MCP的影响

表3各组pH变化情况

CK桂皮油辣椒油生姜油薄荷油丁香油莫发酵后6．86±0．0176．88±0．0106．81±0．009∗6．90±0．0086．90±0．0066．85±0．0026．85±0．007

*均值差值在0.05 级别上较显著。

3 讨论

在反刍动物养殖过程中，CO2和CH4的排放不仅造成温室效应，而且随CH4排放而损失的能量约占饲料总能的2%～15 %[7]。瘤胃内甲烷产生是有机物发酵的必然产物。通过抑制瘤胃发酵过程中甲烷的产生，可以提高反刍动物对能量利用效率，改善环境[8]。MCP则是反刍动物最主要的氮源供应者，能提供蛋白需要量的40%～80%，MCP合成需要各种营养物质的供应，包括碳水化合物、维生素、微量及常量元素等，而维持微生物生长最主要的营养源是能量和蛋白质。了解瘤胃MCP合成的因素对于进一步研究动物营养调控技术有十分重要的意义[9]。pH是一项反映瘤胃内环境稳态的指标，它受唾液分泌量、有机酸积累和日粮性质的影响。pH过高或过低对瘤胃微生物的生长、发育和发酵均产生不利影响[10]。本实验中只有辣椒油处理组发酵液pH显著降低，而在本实验中，辣椒油促进了甲烷生成，所以后续实验可以不予考虑。桂皮油、生姜油、薄荷油、丁香油处理组pH值与对照相比差别不大，说明添加一定水平的这几种油不会改变瘤胃液pH环境。

目前，肉桂油作为一种天然瘤胃调控剂研究得比较多[10-11],而对于桂皮油的研究较少。本实验中，桂皮油在发酵过程中基本抑制了甲烷产生，在发酵12 h、24 h均也显著抑制了CO2生成，这在相当程度上减少了对环境的破坏与饲料的能量损失。但桂皮油处理的MCP含量也有所降低，因此后续研究应该以现有的添加水平为准，适当降低桂皮油添加水平，以期找到一个既能有效降低甲烷又能促进瘤胃微生物发酵的适宜水平。薄荷油则抑制甲烷效果显著，只是随着发酵时间延长，薄荷油的消耗，抑制作用也相应降低，这与Agarwal N[12]等的报道一致。而且薄荷油处理也降低了CO2生成，MCP含量也未受多大影响，故可以考虑其作为瘤胃调控剂成分进一步研究。生姜油和丁香油的抑制甲烷效果不明显，只在发酵12 h时，有部分降甲烷效果，之后反而促进了甲烷生成。这可能是与这2种油中能抑制甲烷的有效成分少，消耗快，而其中的其它成分又作为营养为产甲烷菌利用所致。只不过丁香油抑制甲烷效果又比生姜油稍好，后续促进产甲烷效果也没生姜油明显。其处理的MCP含量也明显高于生姜油处理组。丁香油的抑制甲烷效果与金恩望等研究结果一致，对瘤胃发酵基本无调节作用。

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EffectsofEssentialOilonBuffalo′sRumenFermentationandMethanogenesisinVitroGasProduction

HUANG Jiangli,WANG Dongsheng,ZHANG Zhihong,ZHANG Guohua,TIAN Xiaojuan, TAN Yinjing,FU Ming,DING Jiannan*

(Institute of Biological Resources,Jiangxi Academy of Sciences,330096,Nanchang,PRC)

An in vitro gas production trial was conducted to study the effects of different essential oil on subsequent 36 h buffalo′s rumen fermentation and methanogenesis.Compared to the control,the results showed that,(1)Cinnamon oil almost completely inhibited the methanogenesis (P<0.05),also significantly reduced the carbon dioxide output (P<0.05),and the microbial crude protein (MCP) was reduced by 15%.(2)Peppermint oil were significantly inhibited the methanogenesis at 12 h and 24 h of fermentation (P<0.05),but there was no effect on the production of carbon dioxide;at 36 h of fermentation,the effect of inhibiting methanogenes is not obvious,but the carbon dioxide output was significantly reduced.the MCP was reduced by 12.8%.(3)ginger oil and clove oil′s inhibition of methanogenesis is not obvious,only at the 12 h of fermentation has a little effect,but it can promote the methanogenesis after that.(4)among five kind of essential oils,only the chili oil reduced the pH significantly (P<0.05),but it also promoted the methanogenesis.

essential oil;in vitro gas production;rumen fermentation;methanogenesis

2014-03-26;

2014-05-06

黄江丽(1980-)，女，湖南资兴人，硕士研究生，助理研究员，主要从事微生物生态学研究工作。

江西省科技支撑计划项目“反刍家畜降甲烷微生态制剂研究”；江西省科学院普惠项目“瘤胃甲烷调控剂的筛选和优化组合”。

*通讯作者：丁建南(1955-)，男，研究员，研究方向为微生物生态学。Email:jiannanding@yahoo.com.cn。

1001-3679(2014)03-0328-05

S823；S816.7

A