盐酸夫拉平度对人骨肉瘤细胞MG63细胞周期及凋亡的影响

李 洁,施佳辰,李啸然,李月白#, 全碧波,宋 石,王义生

1)郑州大学基础医学院生物化学教研室 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院 郑州 450001 3)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

盐酸夫拉平度对人骨肉瘤细胞MG63细胞周期及凋亡的影响

李 洁1),施佳辰2),李啸然1),李月白1)#, 全碧波1),宋 石1),王义生3)

1)郑州大学基础医学院生物化学教研室 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院 郑州 450001 3)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

#通讯作者，女，1961年1月生，博士，教授，研究方向：肿瘤分子生物学,E-mail：liyuebai@zzu.edu.cn

盐酸夫拉平度；MG63；凋亡；CDK

目的：观察不同浓度盐酸夫拉平度(FP)对人骨肉瘤MG63细胞增殖活力、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养MG63细胞，取对数生长期增殖旺盛细胞分为对照组和不同浓度FP干预组。MTT比色法测定不同浓度的FP对细胞增殖活性的影响；流式细胞术检测不同浓度的FP干预24和48 h后细胞周期变化和凋亡情况；RT-PCR测定不同浓度FP干预后，细胞周期相关基因表达的变化；Western blot检测细胞内CDK2蛋白表达变化。结果50～2 000 nmol/L FP可抑制MG63细胞增殖活性，且有时间和浓度依赖性(F时间=319.470，F浓度=616.988，P均<0.001)；不同浓度的FP分别干预MG63细胞不同时间后均可引起细胞G2期阻滞(F24 h=6.805，F48 h=12.000，P均<0.001)，凋亡率增加(P均<0.001)，且可明显降低MG63细胞中CDK2、Survivin mRNA及CDK2蛋白的表达(FmRNA=415.517、15.068，F蛋白=50.405，P均<0.001)。结论FP可抑制人骨肉瘤MG63细胞增殖及周期相关蛋白的表达，同时使细胞G2/M期阻滞并诱导细胞凋亡。

骨肉瘤是一种原发恶性肿瘤，以青少年为主要发病人群，其具有很强的侵袭能力，发病迅猛，恶性程度高，病死率惊人[1]。恶性肿瘤强大的增殖能力导致其分化水平很低，同时，细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)-Cyclin蛋白复合物调节分化相关的关键基因，因此，以抑制CDK激酶活性为目标的靶向药物将有效控制细胞增殖能力，提高分化水平，同时能够诱导细胞凋亡[2-3]。CDK抑制剂夫拉平度(flavopiridol，FP)对多种CDK表达有抑制作用，因此，可产生明显细胞周期阻滞作用，明显抑制肿瘤[4]。有研究[5-6]报道，FP能够明显抑制EFTs细胞生长，同时，FP对耐药肉瘤细胞具有同样的作用。该研究选取具有典型肿瘤特征和良好代表性的MG63骨肉瘤细胞系为实验对象，观察不同浓度FP作用于MG63细胞后对细胞增殖活力以及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1试剂FP、MTT、DMSO(美国Sigma公司)，人骨肉瘤细胞株MG63(北京协和细胞资源中心)，胰蛋白酶(美国Gibco公司),胎牛血清、DEPC、PCR扩增试剂盒(加拿大Fermentas公司)，RPMI 1640培养液(北京索莱宝科技有限公司)，Annexin V-FITC试剂盒(南京凯基公司)，其余试剂均为国产分析纯。

1.2人骨肉瘤细胞系MG63的培养使用含体积分数10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，在细胞瓶内接种细胞后置入37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数期、增殖旺盛细胞进行连续培养。

1.3细胞增殖活力的MTT法检测取对数生长期的MG63细胞，调细胞密度为2×104mL-1，接种于96孔培养板，每孔200 μL。细胞贴壁之后，弃去培养液，然后加入含FP浓度依次为50、100、200、300、400、500和2 000 nmol/L的培养液培养细胞。对照组不加药，并设置调零孔，每组设置6个复孔，分别培养24、48和72 h，之后每孔加入MTT，4 h之后弃去上清液，加入DMSO 150 μL，终止反应。以调零孔光密度值(OD)调零校准，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测各孔的OD值。生长抑制率=[1-(受试组OD值)/(对照组OD值)]×100%。

1.4不同浓度FP干预对MG63细胞周期的影响取对数增殖期细胞，制成2×10 mL-1单细胞悬液，接种于75 cm2培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养，贴壁后，加入200和400 nmol/L FP的RPMI 1640培养液，培养24和48 h，每个时间点都设置无药对照组。收集细胞，加入体积分数70%的冷乙醇固定，放于4 ℃冰箱过夜，次日用流式细胞仪对样本进行细胞周期分析。每组均设3个平行样本。

1.5不同浓度FP干预对MG63细胞凋亡的影响细胞培养、分组同1.4。取1×106个细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS，重复以上操作。之后加入500 μL的Binding Buffer，轻轻振荡使细胞悬浮，后依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI 轻轻混匀，室温避光反应15 min。随即用流式细胞仪进行检测。每组均设3个平行样本。

1.6不同浓度FP干预对MG63细胞中CDK2和SurvivinmRNA表达的影响Trizol法提取总RNA，按RT-PCR试剂盒说明进行操作。CDK2上游引物序列5’-CCGCCTGGACACTGAGACT-3’，下游引物序列5’-GTGGAGGACCCGATGGA-3’，扩增产物大小为270 bp；Survivin上游引物序列5’-CAAGGAC CACCGCATCTC-3’，下游引物序列5’-CCAAGGGT TAATTCTTCAAACTG-3’，扩增产物大小为255 bp。β-actin上游引物序列5’-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3’，下游引物序列5’-AAGGAAGGCT GGAAGACTGC-3’，扩增产物大小为540 bp。PCR的扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35次循环；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，以目的基因与内参条带灰度值的比值为mRNA相对表达量。每组均设3个平行样本。

1.7不同浓度FP干预对MG63细胞中CDK2蛋白表达的影响用100、200和300 nmol/L的FP干预MG63细胞5和10 d，以不加FP培养的细胞作对照，收集各培养瓶中细胞，提取细胞总蛋白。蛋白样品以SDS-PAGE分离，然后通过半干转印迹法转移至NC膜上。将NC膜放入盛有50 g/L脱脂牛奶的托盘中，封闭2 h。封闭后的NC膜用TBS-T漂洗液进行漂洗。然后加入1:200稀释的一抗(TBS-T配制)，4 ℃孵育过夜。TBS-T漂洗膜3次，10 min/次；加入二抗(按照抗体说明书稀释)，于室温孵育1.5 h，TBS-T漂洗3次，10 min/次。用X光底片进行显影和定影并观察。每组均设3个平行样本。

1.8统计学处理采用SPSS 18.0进行分析。应用析因设计的方差分析比较不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞增殖抑制率、CDK2和Survivin mRNA及CDK2蛋白表达水平的变化，应用多元方差分析法比较不同浓度FP培养24和48 h后MG63细胞周期的变化，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较不同浓度FP培养24和48 h后MG63细胞凋亡的变化，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度FP干预不同时间后MG63细胞增殖活力的变化见表1。在24～72 h细胞增殖抑制率随时间增长而增加；相同时间点，细胞增殖抑制率随着药物浓度(200～500 nmol/L)的增加而增加。

表1 不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞增殖抑制率的变化(n=3) %

F浓度=616.998，F时间=319.470，F交互=18.234，P均<0.001。

2.2不同浓度FP培养24和48h后MG63细胞周期的变化见表2。结果提示FP作用24和48 h均可引起MG63细胞周期于G2/M期阻滞，并且在一定浓度范围内，药物浓度与阻滞效应呈正比。

表2 不同浓度FP作用MG63细胞24和48 h对细胞周期分布的影响(n=3) %

多元方差分析显示：F24 h=6.805，P=0.004；F48 h=12.000，P<0.001。

2.3不同浓度FP培养24和48h后MG63细胞凋亡的变化见表3。

表3 不同浓度FP培养24和48 h后MG63细胞凋亡的变化(n=3) %

*:与0 nmol/L组相比，P<0.05；#：与200 nmol/L组相比，P<0.05。

2.4不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中CDK2和SurvivinmRNA表达水平的变化见表4、5。

表4 不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中CDK2 mRNA表达水平的变化(n=3)

F浓度=3 289.631，F时间=204.705，F交互=415.517，P均<0.001。

表5 不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中Survivin mRNA表达水平的变化(n=3)

F浓度=719.683，F时间=160.228，F交互=15.068，P均<0.001。

2.5不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中CDK2蛋白水平的变化见图1、表6。

图1 不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中CDK2蛋白水平的变化

表6 不同浓度FP培养不同时间后MG63细胞中CDK2蛋白水平的变化(n=3)

F浓度=382.862，F时间=547.093，F交互=50.405，P均<0.001。

3 讨论

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，其较强的侵袭能力并可发生早期转移成为骨肉瘤致死的主要原因[7]。由于发病机制尚未明确，目前仍无有效的治疗手段，所以骨肉瘤患者预后差。因此，阐明其发病机制并找到有效治疗靶点刻不容缓。

根据目前的研究结果显示，骨肉瘤遗传学上涉及了多个染色体区带发生缺失、增加和重排，并存在rb、p53、cMyc等多个基因参与的信号通路脱调控。其中Rb蛋白作为细胞周期调节的关键因子之一，可在低度磷酸化状态时与转录因子E2F结合阻止细胞由G1期进入S期，而这一过程与CDKs有着微妙的关系。

FP是一种半合成黄酮类衍生物，最初由药用植物提炼，已有研究发现，FP可在除骨肉瘤细胞外的多种肿瘤细胞(如乳癌细胞)中抑制CDKs(CDK1、CDK2、CDK3、CDK4等)的活性，使细胞阻滞于G1、G2期，并可以有效诱导多种体外培养的肿瘤细胞发生凋亡[8-9]。此外，FP还可通过影响细胞内其他关键基因，如cyclin B、VEGF、survivin、bcl-2、cyclin D、p21等的转录与表达，上调HIF-1、E2F1和P53等蛋白表达水平等途径对细胞产生影响[10]。

该实验研究显示，在骨肉瘤细胞中，FP浓度在200～500 nmol/L范围内时作用于MG63细胞可抑制细胞生长并诱导细胞发生凋亡，且抑制率和凋亡率随浓度增大而升高，具有浓度、时间依赖性。作者用200和400 nmol/L的FP分别作用于MG63细胞24和48 h后均引起不同程度的G2期阻滞，并伴随着CDK2表达量的下调。众所周知，FP对于CDKs具有广泛的抑制作用，因此推测骨肉瘤MG63细胞中的这一现象与CDK2的表达下调密切相关。此外，该研究根据FP能够降低Survivin表达，推断FP诱导MG63细胞凋亡可能与调控Survivin的表达有关，通过作用于凋亡信号通路下游，诱导细胞凋亡。

综上所述，该实验阐明了FP可通过抑制CDK2和Survivin的表达使人骨肉瘤MG63细胞发生周期阻滞和诱导其凋亡，研究结果为临床骨肉瘤的治疗提供了新的实验依据，也对FP的抗肿瘤应用提供了可靠理论价值。

[1]赵意华,陈清汉,华海婴,等.氯化锂对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表达的影响[J].郑州大学学报:医学版,2012,47(4):502

[2]Carassou P,Meijer L,Le Moulec SA,et al.Cell cycle and molecular targets: CDK inhibition[J].Bull Cancer,2012,99(2):163

[3]Bernardi A,Frozza RL,Hoppe JB,et al.The antiproliferative effect of indomethacin-loaded lipid-core nanocapsules in glioma cells is mediated by cell cycle regulation, differentiation, and the inhibition of survival pathways[J].Int J Nanomedicine,2013,8:711

[4]Liu XR,Shi SH,Lam F,et al.CDKI-71, a novel CDK9 inhibitor, is preferentially cytotoxic to cancer cells compared to flavopiridol[J].Int J Cancer,2012,130(5):1216

[5]王孟昌,张斌.Flavopiridol诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的分子机制[J].西安交通大学学报:医学版,2011,32(2):201

[6]Caracciolo V,Laurenti G,Romano G,et al.Flavopiridol induces phosphorylation of AKT in a human glioblastoma cell line, in contrast to siRNA-mediated silencing of Cdk9:implications for drug design and development[J].Cell Cycle,2012,11(6):1202

[7]刘志礼,尹庆水,舒勇,等.Aurora-B、Ki-67在骨肉瘤中的表达与远处转移的关系[J].解放军医学杂志,2011,36(11):1197

[8]Schmerwitz UK,Sass G,Khandoga AG,et al.Flavopiridol protects against inflammation by attenuating leukocyte-endothelial interaction via inhibition of cyclin-dependent kinase 9[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(2):280

[9]Mahoney E,Lucas DM,Gupta SV,et al.ER stress and autophagy: new discoveries in the mechanism of action and drug resistance of the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol[J].Blood,2012,120(6):1262

[10]Nelson DM,Joseph B,Hillion J,et al.Flavopiridol induces BCL-2 expression and represses oncogenic transcription factors in leukemic blasts from adults with refractory acute myeloid leukemia[J].Leuk Lymphoma,2011,52(10):1999

(2013-09-22收稿 责任编辑赵秋民)

Flavopiridol suppresses cell cycle and induces apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell line

LIjie1),SHIJiachen2),LIXiaoran1),LIYuebai1),QUANBibo1),SONGShi1),WANGYisheng3)

1)DepartmentofBiochemistry，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 3)DepartmentofOrthopedicSurgery，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

flavopiridol；MG63；apoptosis；CDK

Aim: To investigate the influence of flavopiridol(FP) on proliferation, cell cycle and cell apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell lines. Methods: The cells were cultured with RPMI1640 medium containing 10% of fetal bovine serum as usual, and treated with different concentration FP. MTT assay was used to detect the influence of different dose FP treatment on cell proliferation. Flow cytometry (FCM) was used to determine the cycle distribution and apoptosis status of the cells which treated with various concentration FP for 24 and 48 h respectively.RT-PCR was used to test the mRNA expression of cell cycle related genes after the FP intervention.The protein expression of CDK2 in cells after FP treatment was detected by Western blot. Results: FP could inhibit the cell proliferation in the range of 50 to 2 000 nmol/L, the inhibition rate also increased with time at the range from 24 to 72 h(Fconcentration=616.988,Ftime=319.470，P<0.001). The different concentrations of FP that respectively acting on the MG63 cells for different times could arrested MG63 cells at G2phase obviously (F24 h=6.805，F48 h=12.000，P<0.001) and increased apoptosis rate(P<0.001), and could also decrease the mRNA level of CDK2 and Survivin obviously in MG63 cells and down-regulate the expression of CDK2 protein as well(FmRNA=415.517，15.068，Fprotein=50.405，P<0.001). Conclusion: The CDK inhibitor flavopiridol can inhibit the cell proliferation and the expression of cell cycle related protein in human osteosarcoma MG63 cell, and induce the cell G2/M phase arrest and the cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.020

R73-3