煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞环氧化酶-2 mRNA表达的影响*

杨维超，逯 洋,李 娟，晋乐飞,刘文佳，燕 贞，吴卫东

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001 2)新乡医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室 新乡 453003

煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞环氧化酶-2mRNA表达的影响*

杨维超1)，逯 洋1),李 娟1)，晋乐飞1),刘文佳1)，燕 贞1)，吴卫东2)#

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001 2)新乡医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室 新乡 453003

#通讯作者，男，1963年10月生，博士，教授，研究方向：分子毒理学，E-mail:xxmu2013@gmail.com

煤焦沥青烟提取物；人支气管上皮细胞；环氧化酶-2

目的：探讨煤焦沥青烟提取物(CTPE)对人支气管上皮细胞环氧化酶-2(COX-2) mRNA表达的影响。方法应用RT-PCR方法测定不同质量浓度(2、4、8 mg/L)CTPE作用不同时间(2、4、8 h)对人支气管上皮BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达水平影响。使用放线菌素(Act)D(1 mg/L)作用于BEAS-2B细胞，观察其对2 mg/L CTPE作用30 min后的BEAS-2B细胞COX-2基因转录的影响。利用ZnSO4溶液刺激BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达，去除ZnSO4后，加入1 mg/L的Act D 30 min，检测CTPE 作用不同时间点(0、2、4 h)的COX-2 mRNA表达的变化。结果2、4、8 mg/L CTPE刺激均可以使BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达水平升高(F组间=71.750,F时间=93.120,F交互=17.300，P<0.001), 2 mg/L是最佳剂量。用Act D(1 mg/L)预处理细胞30 min，可降低CTPE对COX-2 mRNA表达的诱导作用(FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001)。使用ZnSO4刺激，然后使用Act D终止COX-2 mRNA合成后，不同时间点，CTPE组和对照组COX-2 mRNA的表达差异有统计学意义(F组间=365.700,F时间= 37.780,F交互=6.240，P<0.001)。结论CTPE可以通过转录水平和转录后水平诱导人支气管上皮细胞COX-2 mRNA的表达。

煤焦沥青是煤炭炼焦过程中产生的副产品,具有致癌性，可以诱发肺癌。肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，细胞中环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的过度表达与肺癌的发生密切相关。COX-2是诱导型酶，当细胞受到细胞因子、化学致癌物、内毒素等刺激作用后开始表达。研究[1-4]显示COX-2是促癌的一种关键因子。作者以人支气管上皮BEAS-2B细胞作为研究对象，测定煤焦沥青烟提取物(coal tar pitch extract，CTPE)对BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达影响。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂中温煤焦沥青(安阳钢铁公司炼焦车间提供，常温保存)，CTPE溶液由课题组前期制备[5]，BEAS-2B细胞(购自美国ATCC公司)为猴空泡病毒40永生化正常人支气管上皮细胞，DMSO(天津市化学试剂三厂)，EB(北京索莱宝生物科技有限公司)，硫酸锌(ZnSO4,上海化学试剂厂总厂所属上海试剂厂二厂)，溴酚蓝、PBS粉剂(北京索莱宝生物科技有限公司)，尼康YS100显微镜(日本Nikon公司)，723可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，MX3000-RT-PCR仪(日本SANYO公司)，超净工作台(广东康力医药有限公司)。

1.2分组与处理采用BEAS-2B细胞半数抑制浓度作为最大染毒浓度，根据前期课题组实验结果[5]，实验设置2、4、8 mg/L染毒组和溶剂对照组，染毒组采用对应浓度的CTPE溶液处理，溶剂对照组采用体积分数0.1% DMSO处理。每个剂量组设置3个复孔，分别作用2、4、8 h。

1.3COX-2mRNA表达的检测采用RT-PCR方法。收集细胞，提取RNA，将RNA逆转录为cDNA。对逆转录的cDNA进行实时定量RT-PCR扩增。 反应体系为：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL,上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，与DEPC水混匀，终体积为25 μL。反应条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循环40轮;最后72 ℃延伸10 min。β-actin作为内参，用比较阈值法[5]计算COX-2 mRNA相对表达水平。

1.4放线菌素(Act)D转录抑制实验将BEAS-2B细胞接种于12孔培养板，设DMSO对照组和 CTPE组、Act D 对照组和CTPE组，每组3孔。细胞生长至对数生长期时，DMSO对照组和 CTPE组加入1 mg/L DMSO，Act D 对照组和CTPE组加入1 mg/L Act D， 作用30 min后，再分别向DMSO CTPE组和Act D CTPE组加入2 mg/L CTPE。作用4 h后收集细胞,用1 mL Trizol提取细胞 RNA。用RT-PCR法检测COX-2 mRNA水平。

1.5CTPE对COX-2mRNA稳定性的影响采用COX-2 mRNA降解测定法。BEAS-2B细胞接种于12孔培养板上，培养至对数生长期，加入阳性刺激物(ZnSO4)作用BEAS-2B细胞12 h[6]，然后去除ZnSO4，各孔中加入1 mg/L Act D，温育30 min之后将细胞分为对照组(DMSO)和CTPE (2 mg/L)刺激组。CTPE作用0、2、4 h后收集细胞，用Trizol提取细胞RNA，用RT-PCR法检测各组细胞COX-2 mRNA的表达水平。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0分析。Act D对BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达抑制的影响和CTPE对BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达的影响及mRNA稳定性的比较采用析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组BEAS-2B细胞COX-2mRNA表达的比较结果见表1。

表1 各组BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达的比较(n=3)

F组间=71.750,F时间=93.120,F交互=17.300，P均<0.001。

2.2ActD转录抑制实验结果见表2。

2.3CTPE对COX-2mRNA稳定性的影响结果见表3。

表2 Act D转录抑制实验

FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001。

表3 不同时间两组BEAS-2B细胞COX-2 mRNA的表达量(n=3)

F组间=365.700,F时间= 37.780,F交互=6.240，P均<0.001。

3 讨论

目前关于COX-2基因表达影响各种疾病发生发展国内外的报道较多。Hida等[7]发现70%的肺恶性腺瘤组织中COX-2高表达。赵媛等[8]在原发性肝细胞癌组织中发现COX-2 蛋白高表达。Khuri等[9]应用原位杂交技术对160例1期非小细胞肺癌患者进行检测，结果发现COX-2的过表达可导致早期患者生存率的下降。而目前煤焦沥青是否可诱导永生化人支气管上皮细胞COX-2表达的相关研究尚未见报道。

该研究结果显示，随着CTPE剂量升高，COX-2 mRNA表达量逐渐下降。分析原因，可能由于CTPE细胞毒性较大， 8 mg/L为其半数抑制浓度[5]，可能超出了细胞能够承载的毒物浓度，所以COX-2 mRNA表达下降。而随着时间的推移，COX-2 mRNA表达先升高后降低，提示COX-2 mRNA有可能会参与转录后调节，即表达升高后一段时间内被降解，这与Wu等[6]的研究结果一致。CTPE刺激可能提高了BEAS-2B细胞内COX-2 mRNA的转录活性。该研究中，染毒浓度2 mg/L、染毒时间为4 h时，CTPE对BEAS-2B细胞COX-2 mRNA表达的影响比较明显，因此采用这一实验条件，用转录抑制剂Act D预处理细胞30 min，观察其对CTPE诱导COX-2 mRNA表达的影响。结果表明，Atc D可显著抑制CTPE对BEAS-2B细胞COX-2的诱导作用，进而也提示转录调节机制参与了CTPE对BEAS-2B细胞COX-2表达的诱导作用。

由于mRNA的稳定作用是转录后调控中一种重要机制[10-14]，所以作者通过采用mRNA降解试验观察CTPE对COX-2 mRNA的稳定作用，从而证实CTPE是否在转录后层面上影响COX-2 mRNA 的表达。该研究结果表明CTPE能在转录后维持COX-2 mRNA高水平表达，其机制可能是CTPE能够减缓COX-2 mRNA的降解速度，提升其稳定性。

综上所述，CTPE可能在转录及转录后的水平诱导人支气管上皮细胞COX-2 mRNA的表达增加，具体机制需进一步实验验证。

[1]李帅帅，孙军. PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在姜黄素抑制人肝癌细胞Cox-2表达中的作用 [J]. 解放军医学杂志，2014，39(1)：30

[2]李宝龙，何灿霞，王凤前，等.莱菔硫烷对膀胱癌细胞增殖抑制作用 [J]. 中国公共卫生，2012，28(2)：189

[3]Chen JJ, Huang WC, Chen CC. Transcriptional regulation of cyclooxygenase-2 in response to proteasome inhibitors involves reactive oxygen species-mediated signaling pathway and recruitment of CCAAT/ enhancer-binding protein delta and CREB-binding protein [J]. Mol Biol Cell, 2005, 16 (12): 5579

[4]赵丽，刘林嶓.皮肤癌组织中环氧合酶-2和缺氧诱导因子-1α的表达及微血管密度测定 [J].郑州大学学报：医学版，2008，43(2):210

[5]李智涛,冯艳铭,王威,等. 煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究 [J].工业卫生与职业病, 2011, 37(3):129

[6]Wu W，Silbajoris RA, Cao D,et al.Regulation of cyclooxygenase-2 expression by cAMP response element and mRNA stability in a human airway epithelial cell line exposed to zinc [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008,231(2):260

[7]Hida T,Yatabe Y,Achiwa H, et al. Increased expression of cycl-ooxygenase 2 occurs frequently in human lung cancers, specif ically in adenocarcinomas[J].Cancer Res,1998，58(17): 3761

[8]赵媛，张连峰，刘蔚，等.原发性肝细胞癌组织中环氧化酶-2及E-钙黏蛋白的表达[J].郑州大学学报：医学版，2011，46(4):581

[9]Khuri FR, Wu H, Lee JJ, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stage Ⅰ non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res ，2001，7 (4):861

[10]Novoa I,Gallego J,Ferreira PG,et al.Mitotic cell-cycle progression is regulated by CPEB1 and CPEB4-dependent translational control [J].Nat Cell Biol,2010,12(5):447

[11]White NM, Chow TF, Mejia-Guerrero S, et al. Three dysregulated miRNAs control kallikrein 10 expression and cell proliferation in ovarian cancer [J].Br J Cancer, 2010,102(8):1244

[12]Lee HH,Vo MT,Kim HJ,et al.Stability of the LAST2 tumor suppressor gene is regulated by tristetraprolin [J].J Biol Chem, 2010, 285(23):17329

[13]Inui M,Martello G,Piccolo S.MicroRNA control of signal transduction [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(4):252

[14]余光创,秦宜德,伯晓晨,等. 依赖于5’端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控 [J].中国生物化学与分子生物学报, 2007,23(11):881

(2013-11-17收稿 责任编辑李沛寰)

Effect of coal tar pitch smoke extract on cyclooxygenase-2 mRNA expression in human bronchial epithelial cells

YANGWeichao1),LUYang1),LIJuan1),JINLefei1),LIUWenjia1),YANZhen1),WUWeidong2)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)DepartmentofOccupationalHealthandEvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

coal tar pitch extract; human bronchial epithelial cells; cyclooxygenase-2

Aim: To examine the effect of coal tar pitch smoke extract(CTPE) on COX-2 gene expression in human bronchial epithelial cells. Methods:The human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) was used as an in vitro model. CTPE induced COX-2 mRNA expression were measured by RT-PCR. Actinomycin D，a transcription inhibitor, was applied to test the effect of CTPE on COX-2 gene transcription. mRNA decay assay was used to observe the effect of CTPE on COX-2 mRNA stability at post transcriptional level. Results: CTPE stimulation increased COX-2 mRNA expression in BEAS-2B cells(Fgroup=71.750,Ftime=93.120,Finteraction=17.300，allP<0.001). Pretreatment of BEAS-2B cells with Actinomycin D (1 mg/L),for 30 min could significantly reduce the effect of CTPE on COX-2 mRNA expression (FAct D=174.203,FCTPE=260.312,Finteraction=188.521，P<0.001). Actinomycin D was used to terminate COX-2 mRNA synthesis elevated by zinc sulfate. At different time points (0, 2, 4 h) COX-2 mRNA levels were higher in CTPE group than those in control group(Fgroup=365.700,Ftime=37.780,Finteraction=6.240,allP<0.05). Conclusion: CTPE stimulation can significantly increase COX-2 mRNA expression levels in BEAS-2B cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.013

*国家自然科学基金资助项目 81001240

R995