四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞炎症因子白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及血管内皮生长因子的影响

高 慧 刘 真 于慧卿 付 达 郭 娜

(河北省石家庄市中医院心血管内科，河北 石家庄 050051)

四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞炎症因子白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及血管内皮生长因子的影响

高 慧 刘 真 于慧卿 付 达 郭 娜

(河北省石家庄市中医院心血管内科，河北 石家庄 050051)

目的观察四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响。方法将HUVEC细胞株进行传代培养后，将实验用细胞分为3组，正常组、模型组、四妙勇安汤组。正常组将正常的HUVEC细胞加入正常培养液培养；模型组将HUVEC细胞进行缺氧处理后加入正常培养液培养；四妙勇安汤组将HUVEC细胞进行缺氧处理后加入含10%四妙勇安汤醇沉药液的细胞培养液培养。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组IL-6、TNF-α水平，用免疫组化法检测各组VEGF生成量的表达。结果模型组、四妙勇安汤组IL-6、TNF-α及VEGF水平与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，IL-6、TNF-α上升，VEGF下降；但四妙勇安汤组IL-6、TNF-α上升水平及VEGF下降水平均小于模型组(P<0.01)，四妙勇安汤可以改善缺氧HUVEC细胞中IL-6、TNF-α及VEGF水平变化。结论四妙勇安汤对缺氧HUVEC细胞能有效地抑制炎性因子的分泌，促进内皮细胞的增殖，具有抗炎及促进血管新生的作用，对损伤的血管内皮细胞具有一定的保护作用。

四妙勇安汤；脐静脉；内皮细胞；缺氧；炎症趋化因子类

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)是介导机体非特异性炎症反应的关键细胞因子，与心血管疾病关系密切[1-2]。内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的始动因素，其损伤可致多系统功能障碍[3]。自1986年由Ross提出了动脉粥样硬化病发生的慢性炎症假说以来[4]，炎症反应与缺血再灌注损伤的密切关系已成为共识[5]。现代学者研究表明，四妙勇安汤具有抗菌、消炎、镇静、镇痛作用，对冠心病以及急性心肌梗死患者有确切的疗效[6]。本研究将从IL-6、TNF-α及血管内皮生长因子(VEGF)3个不同方面观察四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响，以研究四妙勇安汤对血管缺血灌注损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 1640培养基干粉，美国Invitrogen Gibco 公司；胰蛋白酶，美国Amersco公司；兔抗人第八因子相关抗原多克隆抗体(产品编号bs-0332R)、辣根酶标记链霉卵白素工作液、VEGF，北京博奥森生物技术有限公司；羊抗兔IgG多克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；人TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)定量检测试剂盒、人IL-6 ELISA定量检测试剂盒，上海森雄科技实业有限公司；人HUVEC细胞株，南京凯基生物科技发展有限公司；马血清，上海北诺生物科技有限公司；缓冲甘油，10%福尔马林液，磷酸盐缓冲液(PBS)，Earle's平衡盐溶液(EBS)。

1.2 仪器设备 DL-CJ-1N型无菌实验台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；CO2培养箱，美国Revco公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂；倒置相差显微镜，日本Olympus公司；一次性塑料培养瓶、一次性6孔细胞培养板，美国Costar公司；芬兰雷勃MK3酶标仪，上海雷勃生物技术有限公司；SHA-B水浴恒温微量振荡器，常州国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HUVEC的传代和培养 将HUVEC细胞株采用胰酶消化法传代，收集第4代HUVEC细胞，加入含10%胎牛血清的1640培养液，使细胞重悬，调整细胞数达1×105cells/cm2，然后分装在24孔培养皿中，放入37 ℃的5% CO2培养箱中培养，每日换液1次，1周后长成单层细胞供实验用。

1.3.2 内皮细胞缺血缺氧模型的建立 将传代培养的第4代HUVEC细胞接种于6孔细胞培养板中，孔底预先铺有明胶包被过的盖玻片，待融合成完整细胞单层后弃去原培养液，用无菌PBS洗2次，加入EBS 3 mL，轻轻的将无菌石蜡油600 μL滴入EBS液，使其完整覆盖于EBS液表面，将6孔细胞培养板置于37 ℃的5% CO2培养箱中培养24 h[7]。同时设未加石蜡油的标本为正常对照组。

1.3.3 四妙勇安汤醇沉药液的制备 按原方称取中药(金银花90 g，玄参90 g，当归60 g，甘草30 g)，当归粉碎为粗末，加10倍的70%乙醇浸泡24 h，渗漉，挥干乙醇，约80 mL，备用。金银花、玄参、甘草加水煎煮2次，每次10倍量水，30 min，合并煎液，浓缩至200 mL，放冷，加入95%乙醇至含醇量75%，静置24 h，滤取药液，挥干乙醇，浓缩至150 mL，加入当归液，微热至125 mL，每1 mL相当于2 g药材。

1.3.4 实验分组 四妙勇安汤组：缺氧内皮细胞中加入含10%四妙勇安汤醇沉药液的1640细胞培养液，放入37 ℃的5% CO2培养箱中培养24 h。模型组：缺氧内皮细胞中加入正常1640培养液，放入37 ℃的5% CO2培养箱中培养24 h。正常组：正常细胞加入正常1640培养液，放入37 ℃的5% CO2培养箱中培养24 h。每组均设置10个复孔。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 ELISA法测定IL-6含量 采用双抗体夹心ABC-ELISA法，实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20～25 ℃)。将细胞接种于96孔板上，参照上述缺氧模型及实验分组分别进行实验，每组均设10个复孔。每孔中各加入样品稀释液100 μL，每孔加标准品100 μL，混匀后用加样器吸出100 μL，移至第2孔。如此反复做对倍稀释至第9孔，最后从第9孔中吸出100 μL弃去，使之容积均为100 μL。第10孔为空白对照。待测品孔中每孔各加入待测样品100 μL，将反应板置37 ℃，120 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔中加入第1抗体工作液50 μL。将反应板充分混匀后置37 ℃，60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。将反应板置37℃，60 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应5～10 min。每孔加入50 μL终止液混匀。在492 nm处测吸光值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出相应IL-6含量。

1.4.2 ELISA法测定TNF-α含量 采用双抗体夹心ABC-ELISA法，实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20～25℃)。将细胞接种于96孔板上，参照上述缺氧模型及实验分组分别进行实验，每组均设10个复孔。每孔中各加入样品稀释液100 μL，每孔加标准品100 μL，混匀后用加样器吸出100 μL，移至第2孔。如此反复做对倍稀释至第9孔，最后，从第9孔中吸出100 μL弃去，使之容积均为100 μL。第10孔为空白对照。待测品孔中每孔各加入待测样品100 μL，将反应板置37 ℃，120 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔中加入第1抗体工作液(兔抗人第八因子相关抗原多克隆抗体，1∶100稀释)50 μL。将反应板充分混匀后置37 ℃，60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。将反应板置37 ℃，60 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应5～10 min。每孔加入50 μL终止液混匀。在492 nm处测吸光值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出相应TNF-α含量。

1.4.3 免疫组化法测定VEGF生成量 取出各组10孔细胞培养板各孔中盖玻片，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min。用10%福尔马林液室温固定10 min，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min。10%马血清70 μL室温封闭20 min，加入第1抗体(兔抗人第八因子相关抗原多克隆抗体，1∶100稀释)70 μL，37℃孵育1 h，同时用PBS代替第1抗体作为对照组。PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min，加入生物素标记的第2抗体(羊抗兔IgG多克隆抗体，1∶400稀释)70 μL，37 ℃孵育30 min，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min；二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗。复染，脱水，透明，封片。并于10×40显微镜下观察。

2 结 果

3组对缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF表达的影响比较见表1。

表1 3组对缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF表达的影响比较

与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01

由表1可见，模型组、四妙勇安汤组IL-6、TNF-α及VEGF水平与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，IL-6、TNF-α上升，VEGF下降；但四妙勇安汤组IL-6、TNF-α上升水平及VEGF下降水平均小于模型组(P<0.01)，四妙勇安汤可以改善缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF水平变化。

3 讨 论

血管内皮细胞具有调节血管张力，维持凝血和纤溶系统之间的平衡，调节炎症细胞的聚集，抑制血小板的聚集和活性等作用[8]，它可分泌多种细胞因子，参与组成复杂的细胞因子网络。血管内皮细胞和冠心病的发生发展存在密切的联系，其功能障碍是冠心病发病的始动环节[9]。四妙勇安汤最早见于华佗《神医秘传》，清代医家鲍相敖将此方命名为“四妙勇安汤”，收载于《验方新编》中，其功效为清热解毒，活血止痛。现代药理研究表明，本方能促进血液循环，使冠状动脉扩张，侧支循环增多，从而减轻冠脉缺氧缺血，增加心肌收缩力，改善症状[10]。

IL-6是机体免疫、内分泌调节的主要分子，与炎症调节和免疫反应有关。lL-6在缺血区、缺血周围区均有表达，且以缺血周围区最为明显，再灌注24 h后表达最高，并在缺血再灌注损伤后期仍维持较高水平[11]。研究表明，在冠脉粥样硬化斑块局部和粥样硬化损伤的动脉壁上均发现有IL-6的表达，且表达量是正常组织的10～40倍[12]。IL-6参与冠脉粥样硬化的形成与进展的途径为：①加速脂质沉积，促进粥样斑块形成；②促进冠脉血栓形成；③参与斑块的形成；④促进炎症反应；⑤导致斑块不稳定破裂。本实验结果显示，模型组与正常组相比，IL-6的表达明显升高；四妙勇安汤组与模型组相比，IL-6的表达明显降低，但仍高于正常组水平。因此，推测四妙勇安汤可以影响炎症因子，抑制炎症反应，有稳定斑块作用。

TNF-α是由被激活的单核细胞、巨噬细胞分泌的一种可溶性多肽类细胞因子。心脏巨噬细胞是TNF-α的重要来源，是免疫和炎症反应的主要调节因子[13]。TNF-α可促进动脉粥样斑块形成、扩大，可刺激内皮细胞产生血小板激活因子，还对血管内皮细胞产生直接细胞毒作用，破坏其结构和功能的完整性，促进炎性介质分泌，参与血管平滑肌细胞的增殖、分化和调控，使血管壁增厚，管腔狭窄[14]。本实验结果显示，模型组与正常组相比，TNF-α表达明显升高；与模型组相比，加入四妙勇安汤醇沉药液后TNF-α表达明显降低。因此，推断四妙勇安汤可以抑制炎症反应，从而对血管缺血损伤具有保护作用。

VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，具有增加微血管与小静脉血管的通透性，诱导血管内皮细胞的形态学变化，并促进血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管生成等作用[15]，可提高内皮细胞抗凋亡能力，促内皮损伤修复，防止血小板黏附和血栓形成，还有增加血管通透性和舒张冠脉的作用[16]。本实验结果显示，模型组与正常组相比，VEGF的表达数量明显减少；四妙勇安汤组与模型组相比，VEGF的表达数量明显升高。因此，推测四妙勇安汤可以增加VEGF的生成，促进内皮细胞的合成，以使侧支循环建立，血管新生，保护损伤的内皮细胞。

综上所述，本实验通过建立体外HUVEC缺氧模型，并在此基础上从IL-6、TNF-α的分泌量及VEGF生成量3个不同方面观察四妙勇安汤对缺氧HUVEC的影响，结果表明四妙勇安汤能有效地抑制炎性因子的分泌，促进内皮细胞的增殖，具有抗炎及促进血管新生的作用，从而可发挥中医药整体调节、多靶点的作用特点，为四妙勇安汤临床治疗应用提供了部分实验依据。

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(本文编辑：石 康)

InvestigationofSimiaoyong'andecoctiononIL-6,TNF-αandVEGFinhumanumbilicalveinendothelialcellswithanoxia

GAOHui,LIUZhen,YUHuiqing,etal.

VasculocardiologyDepartment,ShijiazhuangHospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,Hebei,Shijiazhuang050051

ObjectiveTo investigate the effect of Simiaoyong'an decoction on IL-6, TNF-αand VEGF in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with anoxia.MethodsHuman umbilical vein endothelial (HUVEC) cell lines were subcultured.The cells were divided into three experimental groups, the normal group, model group, Simiaoyong'an decoction group.The normal HUVEC in the normal group were cultured in normal culture solution.HUVEC in model group

anaerobic treatment and then were cultured by normal culture solution.HUVEC in Simiaoyong'an decoction group received anaerobic treatment and then were cultured by 10% Simiaoyong'an decoction culture solution.The levels of IL-6, TNF-a and VEGF were measured by ELISA and immunohistochemistry in each group.ResultsThere were significant differences between model group, Simiaoyong'an decoction group and the normal group on the levels of IL-6, TNF-a and VEGF (P<0.01).The levels of IL-6 and TNF-αwas increased, and VEGF was decreased.But the increase of IL-6 and TNF-αand the decrease of VEGF in Simiaoyong'an decoction group was less than that in model group (P<0.01).Simiaoyong'an decoction can improve the levels of IL-6, TNF-a and VEGF in HUVEC with anoxia.ConclusionSimiaoyong'an decoction can effectively inhibit the secretion of inflammatory factors in human umbilical vein endothelial cells with anoxia, promote the proliferation of endothelial cells, have anti-inflammatory and angiogenic effects on vascular endothelial cell injury has a protective effect.

Simiaoyong'an decoction; Umbilical vein; Endothelial cell; Anoxia; Chemokines

高慧(1976—)，女，副主任医师，硕士。从事心血管内科临床及科研工作。

R285.5

A

1002-2619(2014)06-0898-04

2013-08-08)