Sm3+标记抗心磷脂抗体IgM时间分辨荧光免疫分析法的建立

沈洪远，张 健，胡志刚*，叶 燕

(1.无锡市第二人民医院 检验科，江苏 无锡214023；2.南京医科大学附属无锡人民医院 检验科)

抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody，ACA)常见于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，与血栓形成、自然流产或宫内死胎关系密切[1-4]。在自身免疫反应过程中，ACA的变化以IgG和IgM为主[5]。目前对ACA的检测主要方法为酶联免疫分析法[3,6]。酶联免疫分析为大分子有活性的酶标记，在灵敏度、线性范围和稳定性方面有所欠缺，此外，测量精度也不够高，临床上经常发现病人具有抗磷脂综合征(A ntiphoaphulipids vndrome,APS)的症状但抗心磷脂抗体阴性[7-9]。建立灵敏、稳定、线性范围宽、便捷的ACA检测方法有重要临床意义。本试验采用ACA抗原(心磷脂+β2 糖蛋白I)和Sm3+标记的兔抗人IgM抗体，建立稳定的高灵敏度的时间分辨荧光免疫(time-resolved fluoroimmunoassay， TRFIA)法检测人血清中的心磷脂抗体，报告如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂全自动TRFlA检测仪AutoDELFIA-1235为美国Perkin-Elmer公司产品； ACA酶联免疫试剂盒、ACA-IgG抗体标准品为德国AESKU公司产品；人重组β2 糖蛋白I、心磷脂、兔抗人IgM为美国sigma公司产品，Sm3+标试剂和Sm3+发光增强液购自美国Perkin-Elmer公司；N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(DTTA)为德国Sigma公司产品；牛血清白蛋白(BSA)购自卫生部上海生物制品研究所；96孔微孔板为国产聚苯乙烯板，经羧基化处理；Sephadex-G25为美国Pharmacia公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.2固相抗原制备将ACA抗原(人重组β2 糖蛋白I+心磷脂)用50 mmoL/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6缓冲稀释制成包被液，96孔微孔板各孔加100 μl，4℃包被过夜。弃去包被液，冲洗3次，每孔加250 μl 含3 g/L BSA的上述缓冲液封闭，室温放置2 h。弃去封闭液，拍干后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

1.3Sm3+标记抗体的制备Sm3+-兔抗人IgG抗体参照Sm3+标记盒说明书操作。取兔抗人IgM抗体l ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155 moL/L NaCl 的50 mmoL/L Na2CO3-NaHCO3pH 8.5缓冲液。收集蛋白峰，浓缩至2 g/L。取500 μl加入含0.2 mg的Sm3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)冻干粉的小瓶中，25℃磁力搅拌反应20 h。反应液经用80 mmoL/L tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40 cm)层析，全自动TRFlA检测仪检测，收集蛋白峰，稀释后分装冻干保存。

1.4ACA-IgM抗体的测定采用二抗间接法，加用稀释液稀释的血清100 μl 到板条中，25℃振荡反应30 min 后，洗涤4次，然后加分析缓冲液稀释的Sm3+-兔抗人IgM抗体100 μl，25℃振荡反应30 min后，洗涤6次，再加200 μl 增强液振荡5 min，在AutoDELFIA-1235仪上检测荧光信号。最后从标准曲线计算样品中的ACA-IgM抗体的含量。

1.6统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。2种方法检测结果的一致性检验采用相关性分析，并计算相关系数。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Sm3+标二抗的理化和免疫学鉴定Sm3+标记兔抗人抗体经sephadex G-25层析，收集第1洗脱峰，见图1。

注：第1洗脱峰收集的蛋白代表Sm3+标记兔抗人IgM抗体图1 TRFIA检测sephadex G-25洗脱峰

2.2ACA-IgM抗体-TRIFIA的考核数据处理得到ACA-IgM-TRIFIA的标准曲线，如图2所示。x轴代表荧光强度，y轴代表ACA-IgM抗体的浓度(5个标准点的浓度别为4.85、19.4、77.6、310.4、1241.6 MPL U/ml)，结果显示剂量-反应曲线呈良好线性相关。

图2 ACA-IgM抗体-TRIFIA的标准曲线

2.3精密度评价将低、中、高3份血清样品，同时采用TRFIA法检测，进行批内和批间精密度测试。见表1，2。

表1 批内精密度测试(浓度：MPL U/ml，n=20)

表2 批间精密度测试(浓度：MPL U/ml，n=8)

2.5回收率3份已知浓度标本倍比稀释回收率见表3，最低为93.69%，最高为109.06%，均值为101.14%。

2.6相关性实验25例病人血清样品(ACA-IgM抗体浓度范围在4.05-126.1 MPL U/ml)，分别用TRFIA和ELISA 2种方法所测结果的相关系数为0.78，呈高度相关，见图3。

表3 3份已知浓度标本倍比稀释回收率

图3 TRFIA和ELISA相关性分析

2.7检测范围比较将1份 ACA-IgM抗体强阳性的血清标本从2483 MPL U/L倍比稀释至0.151 MPL U/L，ELISA方法较好的线性范围在4.85-310.4 MPL U/L，而TRFIA方法在0.151-2483 MPL U/L都有较好的线性，见图4。

图4 ELISA和TRFIA检测范围比较

2.8临床特异度采用自制TRFIA试剂检测50例健康献血者血清中的ACA-IgM抗体，阴性49份，阳性1份，特异度为98%。

2.9稳定性试验将TRFIA法和ELISA法试剂盒置于37℃水浴箱7天，再与正常保存的试剂盒做对比(同时进行20例ACA-IgM抗体阳性血清的检测，计算吸光度和荧光计数值的均值)，见表4。TRFIA法结合率仅下降14.7%，而ELISA法结合率下降37.6%，说明TRFIA法试剂盒稳定性较好。

表4 BAS-TRFIA法和ELISA法稳定性比较

3 讨论

当前，检测ACA 多采用ELISA 法，临床上经常发现病人具有抗磷脂综合征的症状但抗心磷脂抗体阴性，ELISA方法存在灵敏度低、线性范围窄、酶标记物不稳定等诸多问题。时间分辨荧光免疫分析技术是近几年快速发展起来的新技术，具有零本底、灵敏度高、重复性好、特异性强、线性范围宽等特点。标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每一秒钟检测样品1000次，结果取平均值，有利于提高检测的准确性[10-12]。TRFIA被广泛用于C反应蛋白[13]、水痘-带状疱疹病毒-IgG抗体[14]、乙型肝炎病毒前S1抗原[12,15]、抗环瓜氨酸肽段抗体[7]、人巨细胞病毒 IgM抗体[8]等的检测。

在以往ELISA法检测ACA过程中，我们也发现有大量ACA弱阳性及临界值的存在，加上准确性和重复性欠佳，给临床诊断这部分患者的自身免疫性状况带来了影响。而本试剂盒灵敏度达到0.1 MPL U/ml，远低于正常参考上限6.93 MPL U/ml，且高、中低3个浓度批内、批间CV均小于10%，从而能够很好地解决这一问题。50例健康献血员血清样本进行ACA的检测，特异性98%，说明本系统不仅灵敏度高，特异性也好。图3结果显示，与进口ELISA试剂相比，2种方法所测结果的相关系数为0.956，呈高度相关，一致性较高，表明在ELISA线性良好的范围内二种方法检测结果高度一致，证明我们建立的TRFIA法结果可靠。将TRFIA法和ELISA法试剂盒置于37℃水浴箱7天，再与正常保存的试剂盒做对比,TRFIA法结合率仅下降14.7%，而ELISA法结合率下降37.6%，说明TRFIA法试剂盒稳定性较好。

检测范围比较试验显示，将一强阳性标本从2483 MPL U/L倍比稀释至0.151 MPL U/L，ELISA方法较好的线性范围在4.85-310.4 MPL U/L，而TRFIA方法在0.151-2483 MPL U/L都有较好的线性，具有很宽的量程。这是由ELISA法和TRFIA法的检测技术范围所决定的，从图4我们发现ELISA法检测ACA-IgM的检测反应信号(吸光度变化范围)从0.05-2.5之间(最低点至最高点只有50倍)，而TRFIA法检测ACA-IgM的检测反应信号(荧光计数值变化范围)从40-80000之间(最低点至最高点有2000倍以上的差异)，TRFIA的检测范围比ELISA提高40倍。

目前，时间分辨荧光免疫分析仪在国内已较普遍使用，仪器全自动操作，误差减少，操作流程短。铕标记兔抗人IgM抗体的制备经专业人员培训后可成功标记，储存时间长、无放射性污染。进口或国产的ACA-IgM抗体商品试剂盒在2500圆左右，每份标本的检测成本约30圆，而本实验室建立的TRFIA法检测ACA-IgM抗体的成本在10元左右，有价格优势。基于以上几个方面，TRFIA法定量检测ACA抗体的方法有望普遍应用。

总之，利用TRFIA方法定量检测 ACA-IgM 抗体具有检测范围宽，试剂盒稳定性好、灵敏度高、特异度好等优点，在自身免疫性疾病诊治、治疗监测及预后判断具有重要意义。

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