石蜡组织存放时间对提取DNA质量的影响

李 丹，刘亚丽，刘 静，李 燕，刘 玉，李江曼，袁 果，王立东*

(1.郑州大学第一附属医院 河南省食管癌重点开放实验室，郑州大学 基础医学院，河南 郑州 450052;2.河南省荣康医院，河南新乡 453003;3.新乡医学院，河南新乡 453003)

石蜡包埋组织(paraffin embedded tissues，FFPET)是形态学研究中的重要资源。近年来，采用石蜡组织进行分子病理学检测，如肿瘤相关基因的突变[1]、靶向药物的分子检测[2]等已迅速从科研领域发展到常规的病理诊断。回顾性的基因研究在现在的肿瘤分子生物学研究中越来越广泛，科研中采集的组织标本多为石蜡包埋组织，因此提取DNA的质量将直接影响分子生物学实验的结果。长时间保存的石蜡组织提取DNA能否满足分子生物学实验的要求，成为许多研究者关注的焦点问题。我们通过比较储存1～3 a的石蜡组织提取DNA的浓度和纯度，讨论常温储存时间对石蜡包埋组织DNA质量的影响。

1 资料和方法

1.1 实验样品

30例石蜡组织(常温储存1 a、2 a和3 a的组织各10例)均来自河南省食管癌重点开放实验室。

组织挑选原则：用直尺测量石蜡组织对应HE切片大小，低倍镜观察，肿瘤组织占整个组织面积的百分比，选择中低分化组织，肿瘤组织在80%以上的蜡块，计算实际肿瘤组织面积=蜡块的长(cm)×宽(cm)×肿瘤组织面积占蜡块组织面积的百分比(%)，挑选实际肿瘤组织面积在2 cm2左右的组织。

常规消毒所用物品，20 um厚连续切膜4片，放入2 μL PE管中备用。

1.2 DNA提取

DNA提取试剂盒购于上海源奇生物医药科技有限公司。石蜡组织先经二甲苯脱蜡(1 mL二甲苯，55 ℃水浴10 min，13 000转离心5 min)3次，无水乙醇洗涤(1 mL无水乙醇，震荡混匀，13 000转离心5 min)2次，标本60 ℃烘干备用。组织脱蜡处理后，按试剂盒提供方法进行DNA抽提。提取DNA置4 ℃冰箱待用。

1.3 DNA质量检测

DNA电泳：采用质量分数为2%琼脂糖进行电泳，采用BTS-20.M全自动数字显影凝胶成像系统和LUV-260D紫外线投射仪进行图像采集。

DNA浓度和纯度：采用NanoDrop-2000型全波长紫外线/可见光扫描分光光度计检测DNA浓度和OD260/OD280比值。

1.4 数据分析

采用SPSS 18.0对数据进行处理，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两组样本间均数比较采用独立样本t检验分析。检验水准：α<0.05。

2 结果

2.1 石蜡包埋组织DNA琼脂糖凝胶电泳显影

琼脂糖凝胶电泳显示：石蜡包埋组织DNA基因组DNA几乎不可见，仅有两例储存1 a的石蜡包埋组织可见基因组DNA。DNA降解明显，见图1。

图1 石蜡组织DNA琼脂糖凝胶电泳图(自上而下分别为储存1 a、2 a、3 a的石蜡组织提取的DNA)

2.2 储存1～3 a的石蜡包埋组织DNA浓度和纯度比较

石蜡包埋组织储存时间越长，提取DNA的浓度越低，储存1～3 a的石蜡包埋组织提取DNA的浓度存在明显差异(F=3.96，P=0.04)。两两比较，储存1 a的组织提取DNA的浓度明显高于储存3 a(P<0.05)，储存1 a与2 a和储存2 a与3 a的组织提取DNA浓度无差异(P>0.05)。储存1～3 a的石蜡包埋组织提取DNA的纯度无明显差异(F=1.67，P=0.21),见表1。

表1 石蜡组织切片提取DNA浓度和OD260/OD280值

3 讨论

我们研究发现，石蜡包埋组织储存时间越长提取DNA的质量越差，且石蜡包埋组织DNA降解严重。组织在用石蜡包埋前需脱水固定，临床上采用的多为甲醛。甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可提供亚甲基(-CH2-)与带有羟基(-OH)、巯基(-SH)和氨基(-NH2)的分子反应，使自由的分子链交联起来，从而发挥对组织的的固定作用，同时也对DNA分子产生不利作用。随着固定时间的延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，导致DNA链的脆性增加，使DNA分子更易发生随机的断裂[3]。

组织在浸蜡和包埋时需将石蜡加热到62 ℃左右，此时DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而导致降解[4]。

在DNA的提取过程中，残留的石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA的释放。文献[5]对比观察切片厚度为2.5 um、5.0 um和10.0 um三种情况下进行二甲苯脱蜡后，提取DNA的质量以10.0 um切片质量最好。切片过薄易造成DNA的机械损伤，鳞状上皮细胞的直径在8 um左右，在我们的实验中切片厚度为20 um，尽量减少对DNA的机械性损伤。

综上所述，石蜡组织是回顾性研究常采用的标本，但其DNA降解严重，石蜡包埋组织储存时间越长，提取DNA的质量越差。我们应根据研究目的基因的大小，进行研究标本的选择，同时研究从石蜡组织中提取高质量DNA的方法，也是一项非常有意义的课题。

参考文献：

[1] Kramer D, Thunnissen F B, Gallegos-Ruiz M I, et al. A fast，sensitive and accurate high resolution melting (HRM) technology based assay to screen for common K-ras mutations [J]. Cell Oncol, 2009, 31 (3): 161.

[2] Baselga J, Rosen N. Determinants of RASistance to anti-epidermal growth factor receptor agents [J]. J Clin Oncol, 2008,26(10):1 582.

[3] Moerkerk PT, Kessels HJ, Ten Kate J, et al. Southern and dot blot analysis of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples from colonic carcinomas [J]. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol， 1990,58(5):351.

[4] Mies C, Houldsworth J, Chaganti RS. Extraction of DNA from paraffin blocks for Southern blot analysis [J]. Am J Surg Pathol, 1991,15(2):169.

[5] 盖宝东，房学东，金仲田，等.提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究[J].吉林大学学报：医学版，2003，29(1)：115.