影响外周血DNA提取质量因素分析

李江曼，韩雪娜，袁 果,2，陈莉莎,2，侯志超，户彦龙,2，李 丹,3，黄 佳，王立东,2*

(1.郑州大学第一附属医院 河南省食管癌重点开放实验室，郑州大学 基础医学院，河南 郑州 450052;2.新乡医学院，河南 新乡 453003;3.河南省荣康医院，河南 新乡 453003)

提取优质的基因组DNA是目前肿瘤分子生物学研究能否取得重要结果的关键。外周血标本采集方便，不受地点、时间等客观因素的影响，是肿瘤分子生物学研究中使用最广泛的标本。血样离体后可立即进行预处理，甚至立即提取DNA、RNA等。但是在科研实践中，病例标本来源多零散，采集的血液样品不能立即处理，需要暂时存放，甚至在-70 ℃以下[1]的深低温冰箱存放数年，待收集样品达一定数量后才能开始进行研究。提取DNA质量的好坏对研究有很大影响[2]。冰冻外周血标本提取DNA的质量是否受存放时间的影响尚不十分清楚。为此，我们通过分析比较-80 ℃冻存1 a、2 a、3 a和4 a的外周血标本提取DNA质量，为研究者提供冻存时间对外周血提取DNA质量影响的相关数据。

1 材料和方法

1.1 样品来源

40例血液标本(-80℃储存1 a、2 a、3 a和4 a的标本各10例)均来自河南省食管癌重点开放实验室生物样品资料库。血样采集：在采集对象知情同意的情况下，抽取5 mL空腹外周静脉血，EDTA-K2抗凝[3]，-80℃冰箱保存备用。

1.2 DNA提取

DNA提取试剂盒FlexiGene DNA Kit(250)[4]购于Qiagen公司。全血标本从-80℃冰箱里取出后，进行梯度解冻(-40 ℃ 24 h，-20 ℃ 24 h，4 ℃ 24 h)。取450 μL全血样品，按试剂盒提供方法进行DNA抽提。提取DNA置4 ℃冰箱待用。

1.3 DNA质量检测

DNA电泳：采用质量分数为1%琼脂糖进行电泳，BTS-20.M全自动数字显影凝胶成像系统和LUV-260D紫外线投射仪进行图像采集。

DNA浓度和纯度：采用NanoDrop-2000型全波长紫外线/可见光扫描分光光度计检测DNA 浓度和OD260/OD280比值。

1.4 数据分析

采用SPSS 18.0对数据进行处理，多组样本间均数比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 冻存1～4 a的外周血提取DNA琼脂糖凝胶电泳显影

凝胶成像系统可见DNA电泳条带均匀、整齐，近加样孔处有一分子量较大的致密荧光条带。见图1所示，不同冻存年份全血样品提取DNA的电泳结果相比基本一致。

图1 冻存1～4 a外周血DNA琼脂糖电泳(自上而下分别为1 a、2 a、3 a、4 a)

2.2 冻存1～4 a的外周血提取DNA浓度和OD260/OD280值比较

冻存1～4 a外周血提取DNA浓度有明显差异(F=2.665，P=0.045，表1)，DNA纯度(OD260/OD280)也有差异(F=2.954，P=0.045，P<0.05，表1)。两两比较结果显示，冻存1 a、2 a和3 a的外周血DNA浓度之间无差异(P>0.05)，冻存4 a的外周血DNA浓度与冻存1～3 a的外周血DNA浓度有明显差异(P<0.05)。随着样品冻存时间的延长，提取DNA浓度呈逐渐降低的趋势。冻存1 a的外周血提取DNA的纯度明显优于2 a及以上的样品(P<0.05)，冻存2～4 a的外周血DNA纯度无明显差异(P>0.05)。

表1 冻存1～4 a外周血提取DNA浓度和OD260/OD280值比较

3 讨论

我们研究发现,-80 ℃冻存1～3 a的外周血提取DNA浓度无明显差异，但冻存4 a的外周血标本提取DNA浓度明显降低，冻存2 a及以上的外周血标本提取DNA的纯度明显降低。外周血标本冻存时间对标本提取DNA的质量有明显的影响。我们仅通过比较提取DNA的浓度和纯度来讨论冻存时间对DNA提取质量的影响，针对不同年份浓度和纯度相似的DNA在进行PCR时是否有差异，我们还未进行讨论。有研究[5]报道，简易冻存2～4周的外周血标本与新鲜标本提取的DNA在进行PCR时无明显差异。

影响外周血DNA提取质量的因素有很多，新鲜标本采集后建议4 ℃储存一周，长时间保存需放入深低温冰箱。标本采集后应上下混匀，以免形成血凝块，影响DNA的提取。在标本运输过程中储存箱温度应保持在4 ℃，尽量减少颠簸。

综上所述，冻存时间对外周血DNA提取有明显的影响，冻存1 a的外周血提取DNA的纯度较2 a及以上的样品优，冻存4 a的样品提取DNA的浓度明显降低。

参考文献：

[1] J萨姆布鲁克，DW拉塞尔.分子克隆实验指南[M].第3版.北京：科学出版社，2003：463.

[2] Utsuno H, Minaguchi K. Influence of template DNA degradation on the genotyping of SNPs and STR polymorphisms from forensic materials by PCR [J]. Bull Tokyo Dent Coll, 2004, 45(1):33.

[3] 朱玉蓉，李金田，张晓梅.细胞裂解法提取全血基因组DNA及两种抗凝剂对其结果的影响[J].实用临床医药杂志，2008，12(1)：73.

[5] 胡卫华，李铁臣，孙惠兰.冻存血与新鲜血的DNA抽提效果的比较研究[J].皖南医学院学报，2005，24(2)：96.