番石榴叶总黄酮抑制泡沫细胞形成及LOX-1表达的实验研究

陈 婧 刘 彬 周迎春 高洁嫦△

1广州医科大学附属第四医院中医科，广州 511447

2广州医科大学附属第二医院心内科，广州 510260

3南方医科大学南方医院中医科，广州 510515

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一个复杂的病理生理过程，其形成的最早期特征是泡沫细胞的出现。抑制泡沫细胞形成甚至逆转泡沫化已成为预防AS和治疗冠心病的重要研究方向。番石榴叶为桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaL的干燥叶，是岭南地区传统中药，中医理论认为其性平，味甘涩，归脾、胃、大肠、肝经，具有止泻、止血、止渴等功用。现代药理研究[1-2]表明，番石榴叶除抗炎、降血糖、降血脂等作用外，其主要活性成分之一的黄酮类化合物对于防治AS同样具有良好疗效[3]，然而其作用机制仍未十分明确。本实验利用THP-1单核-巨噬细胞源性泡沫细胞模型作为研究对象，观察番石榴叶总黄酮对泡沫细胞形成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1购自美国模式菌种收集中心，ox-LDL与CCK-8试剂盒购自广州奕源生物科技有限公司，佛波酯(PMA)购自Merck公司，番石榴叶总黄酮(纯度55.22%)由南方医科大学中医药学院实验室提供，总胆固醇测定试剂盒购自温州东瓯津玛生物科技有限公司，Rabbit polyclonal to LOX-1(一抗)购自Abcam公司，HRP标记的羊抗兔(二抗)购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 THP-1细胞培养及泡沫细胞模型建立 THP-1细胞用含10%FBS的RPMI 1640完全培养液，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。细胞密度控制在106个/ml，每2 d换液1次，采用直接传代法，每4 d传代1次。传至3～5代后用于建模。加入100 ng/ml的PMA，培养48 h，诱导成巨噬细胞，换成无血清培养液，并加入浓度为50 μg/ml ox-LDL，培养24 h，洗涤3次，4%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油红O染色15 min，水洗5 min，苏木精-伊红染色5 min，蒸馏水漂洗返蓝10 min，显微镜下观察其形态特点。

1.2.2 毒性实验及实验分组 THP-1分化为巨噬细胞后，加入用无血清培养液按梯度配制的不同浓度的番石榴叶总黄酮(15 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml、120 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml)。24 h后加入10 μl CCK-8溶液，4 h后用多标记微孔板检测仪在450 nm波长下测定吸光度值，重复3次。根据CCK-8结果，在其安全范围内选取三个浓度分别作为低、中、高三个剂量组，并设空白对照组(无血清培养液)及ox-LDL模型组(无血清培养液+50 μg/ml ox-LDL)作为对照，5组细胞培养24 h后进行各项检测。

1.2.3 酶偶联比色法检测泡沫细胞内胆固醇含量 用NP-40裂解液裂解上述各组细胞，离心，取上清置于-80 ℃保存。用胆固醇标准品(517 mmol/L)作胆固醇标准曲线。各样品与测定试剂按1：20的比例充分混匀，置37 ℃水浴反应10 min。以空白管校零，采用多标记微孔检测仪在545 nm波长下比色读取吸光度值，作出标准曲线，计算样品总胆固醇浓度，以μmol/g蛋白为单位。

1.2.4 Western blot法检测LOX-1的蛋白表达 在各组蛋白样品中加入上样缓冲液，10%SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭90 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜，1×TBS液洗涤3次，10 min/次，加入二抗，37 ℃孵育，1×TBS液洗涤3次，10 min/次。ECL化学发光试剂盒显色，Kodak全光谱多功能活体成像系统曝光。Image tool V3.0图像分析软件读取条带灰度值，实验重复4次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 泡沫细胞模型鉴定

THP-1分化为巨噬细胞后加入ox-LDL作用，经固定和油红O染色，显微镜下见细胞体积增大，细胞质内红染颗粒状脂质空泡较对照组巨噬细胞明显增多，提示细胞内脂质成分增加，说明泡沫细胞基本形成。

2.2 不同浓度番石榴叶总黄酮对巨噬细胞活性的影响

500 μg/ml组细胞活力下降31.97%(P<0.01)，提示该浓度的番石榴叶总黄酮具有一定毒副作用。而250 μg/ml组细胞活力虽与对照组比较无显著差异，但也呈下降趋势。故本研究选取20、40、80 μg/ml三个浓度进行实验，以排除药物自身对细胞的毒性作用。见表1。

表1 不同浓度番石榴叶总黄酮对巨噬细胞活性的影响比较

2.3 番石榴叶总黄酮对细胞总胆固醇含量的影响

与空白对照组比较，ox-LDL模型组细胞总胆固醇含量明显增加(P<0.01)；与ox-LDL模型组比较，三个浓度番石榴叶总黄酮组细胞总胆固醇含量均明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞总胆固醇含量比较

2.4 各组细胞LOX-1的蛋白表达

与空白对照组比较，ox-LDL模型组细胞LOX-1蛋白表达显著升高(P<0.01)。三个浓度的黄酮组LOX-1蛋白含量均低于ox-LDL组(P<0.01)，并随黄酮浓度增高而降低(P<0.05，P<0.01)。见图1。

A：空白对照组；B：ox-LDL模型组；C：黄酮低剂量组；D：黄酮中剂量组；E：黄酮高剂量组

3 讨论

脂质在巨噬细胞中蓄积形成泡沫细胞是AS的最早期病理特征。巨噬细胞通过多种表面受体无限制地摄取ox-LDL及其他配体，导致细胞内大量胆固醇及三酰甘油蓄积而转化成泡沫细胞，从而形成最早的AS病变——脂质条纹。此外，泡沫细胞还可分泌多种炎症因子以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，加速AS进展[4]。

LOX-1是1997年Sawamura等[5]在牛主动脉内皮细胞上发现的一种C型植物血凝集素样氧化低密度脂蛋白受体，可特异性地结合ox-LDL，是参与巨噬细胞摄取ox-LDL的主要受体之一[6]。多项研究[7-8]证实LOX-1与泡沫细胞及AS形成关系密切，因此阻断LOX-1是直接抑制巨噬细胞摄取ox-LDL而形成泡沫细胞的重要靶点。此外，LOX-1还可激活多个细胞信号转导通路，导致血管内皮细胞功能障碍、细胞外基质降解等病理反应，导致AS形成加速并恶化[9-10]。因此，抑制LOX-1的表达是防治AS、保护血管内皮的重要途径。

黄酮类化合物是番石榴叶的主要活性成分之一。黄酮类化合物能有效治疗冠心病、抑制AS，而且分子量小，能被人体迅速吸收，亦能通过血-脑屏障，对治疗心脑血管疾病具有独特优势[11]。本实验结果显示，番石榴叶总黄酮明显下调LOX-1表达，从而有效阻止巨噬细胞摄入ox-LDL而出现胆固醇蓄积，起到了抑制泡沫细胞形成的作用，并且该作用在一定浓度范围内随番石榴叶总黄酮剂量增高而增强。鉴于LOX-1是介导一系列细胞信号通路的重要受体，参与AS斑块形成、进展到破裂的多个阶段，所以能有效作用于这一靶点的番石榴叶总黄酮，除了能在AS形成初期起到抑制作用以外，还可能对冠心病治疗、稳定斑块、保护血管内皮等方面有一定疗效，因而值得继续深入探讨其药效和作用途径。

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