脾肾合剂对顺铂诱导的SD大鼠胃肠损伤的影响*

姚德蛟 陈 玉 蔡 懿 杨 俊 丁芋友 刘 俊 孟春芹

1成都中医药大学附属医院肿瘤科，成都 610072

2成都中医药大学临床医学院，成都 610075

化疗被公认为恶性肿瘤的三大治疗手段之一。但化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也影响了人体的消化系统，最常见的毒性反应为恶心呕吐，其发生率为60%～90%[1]。消化道反应不但影响患者的情绪及进食，还可能造成营养不良、代谢紊乱等并发症，甚至导致患者抗拒或放弃化疗，影响治疗疗效。

化疗诱发恶心呕吐的机制尚不十分清楚，就目前的研究[2]结果显示，化疗药物刺激胃肠道黏膜，导致黏膜释放5-羟色胺(5-HT)，与5-HT受体结合产生神经冲动传入呕吐中枢引起呕吐。5-HT3受体拮抗剂，如昂丹司琼、格拉司琼等能明显减轻化疗所致恶心呕吐，对预防和治疗急性呕吐疗效确切，但对迟发性呕吐疗效较差[3]。中医学认为，毒物(化疗药物)攻伐脾胃，使正气耗伤，健运失司，气机阻滞，胃气上逆而作呕，而“肾在液为唾”、“肾为胃之关”，毒物入脏入腑，伤及脾胃，久之及肾，因此化疗后患者多有恶心呕吐、神疲乏力、厌油、纳差、腹胀、腹泻、盗汗、脱发、腰膝酸软等脾肾亏虚之症。故本文以香砂六君子汤合肾气丸加减组成脾肾合剂，并建立顺铂诱导的SD大鼠胃肠损伤模型，探讨脾肾合剂减轻化疗引起的胃肠损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通SD大鼠80只，雌雄各半，体重(190±25) g，40 d龄，由成都中医药大学实验动物研究中心提供(实验动物许可证号：川实动管使第9号)。

1.2 药物与试剂

脾肾合剂由人参10 g，茯苓10 g，炒白术10 g，陈皮10 g，木香10 g，法夏10 g，砂仁10 g，山茱萸10 g，熟地10 g，制附子5 g，肉桂5 g，牛膝10 g，甘草5 g组成。上述药物均购自成都中医药大学附属医院，经成都中医药大学生药教研室鉴定。用约8倍于药的蒸馏水浸泡药物30 min，水煎20 min后滤液，再予6倍于药蒸馏水煎30 min滤液，两次煎煮而成的滤液混匀，并水浴浓缩成1 g/ml，置于5 ℃冰箱保存备用。顺铂注射液，规格10 mg/2 ml，由江苏豪森药业股份有限公司提供；盐酸格拉司琼注射液，规格3 mg/3 ml，由南通精华制药股份有限公司提供。

血清表皮生长因子(EGF)试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。5-HT抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。10%中性福尔马林溶液由成都中医药大学生物实验室配制。二抗试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。高岭土由苏州中国高岭土有限公司提供。1 kg高岭土粉和10 g阿拉伯树胶加水搅拌后过筛网，80 ℃烘干，制成小颗粒状，与大鼠饲料同时放入饲养笼中。

1.3 动物分组和实验方法

SD大鼠经适应性喂养1周后，随机分为4组，即对照组、模型组、格拉司琼组、脾肾合剂组，每组20只。除对照组外，其余三组大鼠均于第7天按4 mg/kg尾静脉注射顺铂，对照组、模型组、格拉司琼组大鼠每日予以生理盐水20 ml/kg灌胃，格拉司琼组大鼠按2 mg/kg剂量在注射顺铂0、4、8 h后给予尾静脉注射格拉司琼，脾肾合剂组大鼠在格拉司琼治疗基础上，每日予以脾肾合剂20 ml/kg灌胃，连续14 d。将大鼠迅速颈椎脱臼处死，腹主动脉采血，立即取出胃、十二指肠组织，胃条取1 cm×1 cm，十二指肠取胃窦与十二指肠交界处2 cm，其中1 cm肠段与胃条一并放入10%福尔马林液固定48 h，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片4 nm，苏木精-伊红染色。因操作不当，实验第9天模型组有2只大鼠死亡，格拉司琼组第10天有1只大鼠死亡，其余各组无死亡。

1.4 观察和检测指标

1.4.1 一般情况 毛色、神态、体重、进食量、“异食癖”表现。每日17：00 pm记录其进食量，18：00 pm称各组大鼠体重。

1.4.2 组织学观察 观察各组大鼠胃及十二指肠标本绒毛、肌层、浆膜层等形状、出血情况、炎性渗出等。

1.4.3 酶联免疫法(ELISA)测定大鼠血清EGF水平 腹主动脉采血，离心取血清，按试剂盒说明检测EGF水平。

1.4.4 免疫组化法检测大鼠十二指肠嗜铬细胞(ECL细胞)5-HT的表达 取上述苏木精-伊红染色剩余十二指肠段，在10%中性福尔马林溶液中固定，用免疫组化法测定十二指肠5-HT。染色过程采用SP法，即用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶染色及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。IHC染色阳性结果判定：ECL细胞内5-HT表达阳性物质呈黄至棕色椭圆形颗粒状，大多数均匀分布于细胞质内，胞核内无表达，少部分因ECL细胞具有长突伸入肠腔而在腔内可见。用OLYMPUS BX50光学显微镜观察染色结果。每张切片选一定范围，输入图像分析系统，在200倍镜下测量ECL细胞5-HT阳性物质积分密度。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 脾肾合剂对各组大鼠进食量的影响

第1天，各组大鼠之间的进食量差异无统计学意义。第7天和第14天，与对照组比较，模型组大鼠进食量明显减少(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，格拉司琼组大鼠进食量差异无统计学意义，但脾肾合剂组大鼠进食量均明显增加(P<0.05)。见表1。

2.2 脾肾合剂对各组大鼠体重的影响

第1天和第7天，各组大鼠之间的体重差异无统计学意义。第14天，与对照组比较，模型组大鼠体重明显减轻(P<0.05)；与模型组比较，格拉司琼组大鼠体重差异无统计学意义，但脾肾合剂组大鼠体重明显增加(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠进食量的比较

表2 各组大鼠体重的比较

2.3 各组大鼠异食癖情况比较

对照组大鼠进食高龄土量为(0.28±0.03) g，模型组大鼠进食高龄土量为(0.86±0.05) g，模型组较对照组进食高龄土量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，格拉司琼组和脾肾合剂组大鼠进食高龄土量为(0.52±0.02) g和(0.46±0.06) g，明显减少(P<0.05)。

2.4 胃及十二指肠黏膜苏木精-伊红染色结果

对照组大鼠胃及十二指肠绒毛及肌层平整，绒毛表面没有渗出物；模型组大鼠胃及十二指肠浆膜层波浪状，肌层内出血，绒毛表面渗出(主要是白细胞)；格拉司琼组大鼠胃及十二指肠轻度痉挛，绒毛表面无渗出；脾肾合剂组大鼠胃及十二指肠浆膜层轻度波浪形，肌层没有痉挛，绒毛表面无渗出。见图1-2。

2.5 ECL细胞5-HT的表达情况

依据平均光密度检测结果，与对照组比较，模型组大鼠ECL细胞5-HT的表达明显增加，与模型组比较，格拉司琼组和脾肾合剂组大鼠ECL细胞5-HT的表达明显降低。见图3。

A：对照组；B：模型组；C：格拉司琼组；D：脾肾合剂组

A：对照组；B：模型组；C：格拉司琼组；D：脾肾合剂组

A：对照组；B：模型组；C：格拉司琼组；D：脾肾合剂组

2.6 各组大鼠血清EGF水平的比较

对照组大鼠血清EGF水平为(1.40±0.21) pg/ml，模型组大鼠血清EGF水平为(1.35±0.14) pg/ml，模型组血清EGF水平较对照组明显增加(P<0.05)；与模型组比较，格拉司琼组大鼠血清EGF水平为(1.35±0.02) pg/ml，两组无明显差异，但脾肾合剂组大鼠血清EGF水平为(1.41±0.02) pg/ml，较其他各组明显增加(P<0.05)。

3 讨论

化疗呕吐归属于中医“呕吐”范畴，是使用了化疗药物后出现的外邪致内伤的疾病，多数医家认为毒物攻伐脾胃，使正气耗伤，脾胃健运失司，气机阻滞，胃气上逆，临床表现为恶心、呕吐，常伴厌油、纳差、神疲、腹胀、腹泻等。脾胃之症在化疗时即可出现，亦有化疗后出现呕吐者。徐氏[4]指出：肾和脾胃关系为“先天”滋“后天”、“后天”养“先天”。若反复或长期呕吐，“后天”不足以养“先天”，必损及肾。《证治汇补》中记载：“若久呕延及肝肾皆虚，冲气上逆者，用温通柔润之补下焦主治”。肿瘤患者在化疗过程中，脾失温煦，健运失司，聚而为痰、饮、水、湿，阻滞中焦致胃失和降。肾阳不足，命门火衰，临床上出现盗汗、脱发、腰膝酸软等肾虚之症晚于脾胃亏虚之症。因此在化疗时仅顾护脾胃不够，应同时固肾。因此，本文以香砂六君子汤合肾气丸加减组成脾肾合剂。方由人参、茯苓、地黄、法夏、炮姜、山茱萸、砂仁、木香、制附片、肉桂等组成。方中人参具有大补元气，补脾益肺，生津止渴，安神智之功，善治气虚欲脱，脾气不足，肺气亏虚以及血虚阳萎等证。《本草经疏》言：“人参能回阳气于垂绝，……益真气，则五脏皆补矣”。茯苓、法夏、炮姜、山砂仁等健脾和胃，理气止痛。《名医方论》张璐言：“气虚者，补之以甘。……盖人之一身，以胃气为本，胃气旺，则五脏受荫；故凡病久不愈，惟有益胃补肾两途，……。”方中地黄、山茱萸温补肾元，以补益脾胃。《名医方论》柯琴言：“……肾得气而土自生也。且形不足者温之以气，则脾胃因虚寒而致病者固痊，……”。地黄甘微温，归肝肾经，功效养血滋阴，补精益髓。《本草纲目》云：“填骨髓长肌肉，生精血，补五脏内伤不足，通血脉，利耳目，黑须发”。法夏性温，归脾胃、肺经。《药性论》言：“……开胃健脾，止呕吐”。山茱萸味酸微温，归肝肾经，功效补益肝肾，收敛固肾。《别录》云：“强阴益精，安五脏”。现代研究[5]表明，香砂六君子汤能减少胃黏膜瘀血、水肿，减轻炎症细胞的浸润，促进胃液的分泌，改善胃肠道内分泌功能，调节细胞免疫剂体液免疫等。健脾益气药物，如人参、白术、茯苓能提高对化疗的耐受力，对多种化疗药物均有明显的整体解毒作用[6]。半夏生物碱能阻断5-HT受体、多巴胺受体，抑制肠管的兴奋作用[7]。健脾益气中药调节消化道功能，增加胃肠酶和胃泌素分泌，增加小肠吸收功能，促进RNA和蛋白质合成[8]，改善机体营养状况。肾气丸源自《金匮要略》，功用补肾助阳，主治肾阳虚损。明末清初名医傅山辨治呕吐时总结经验特色，病在脾胃，本在肾心[9]。现代很多医家亦从肾论治呕吐，莫剑锋等[10]观察64例采用补脾益肾汤防治胃癌化疗的恶心呕吐反应疗效确切。

本研究建立顺铂诱导的SD大鼠胃肠损伤模型，结果发现，脾肾合剂组大鼠进食量、体重均高于模型组，病理检查胃肠黏膜反应轻，血清EGF增高，同时ECL细胞内5-HT表达较低。EGF增高可抑制胃酸分泌，促进胃肠上皮增生，增加黏膜血流，或促进胃肠黏膜生长，抑制胃肠黏膜的分泌，保护胃肠黏膜。这些是健脾和胃补肾中药增强机体“正气”的表现。综上所述，通过以上研究验证了脾肾合剂减轻化疗后胃肠道的损伤，值得在临床上运用。

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[5] 王建平，魏品康.中西药合用防治顺铂联合化疗所致迟发性恶心呕吐50例[J].实用中医药杂志，2012，28(8)：672-673.

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[7] 卢燕，聂克，林艳艳，等.半夏生物碱含量测定及其对豚鼠离体肠管运动的影响[J].山东中医杂志，2013，8(12)：916-918.

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[10] 莫剑锋，肖航航.自拟补脾益肾汤防治胃癌术后化疗毒副反应的临床观察[J].中医药导报，2008，14(5)：20-21.