心肝同治法及其组方对大鼠缺血心肌梗死面积及新生血管因子表达的影响

林 华 蔡智刚 唐新征

（深圳市福田区中医院·518034）

冠状动脉粥样硬化性心脏病在中医学领域中属“胸痹心痛”范围，作者认为心肝同治法能明显改善心脏缺血，是与促血管新生因子密切不可分，故促进血管生成为中医药防治冠心病的可能机制之一。故拟定心肝同治组方，用于治疗缺血性心脏病，可以显著改善患者的心痛症状。本研究旨在探讨心肝同治组方对急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）以及血管生成素-1（Ang-1）、血管生成素-2（Ang-2）表达的影响，为该方的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

选用雌性Wistar 大鼠60 只，体质量220～260g，由广东省实验动物中心提供。

1.2 药品

心肝同治法的基本处方组成：白参10g，柴胡10g，姜黄15g，熊胆0.1g，九香虫5g，白芥子3g，白芍15g；制剂：人参、熊胆、九香虫粉碎成细粉，混匀；姜黄、柴胡、白芥子、白芍等五味加水煎煮2 次，每次1.5 小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.23-1.43 的稠膏，真空干燥，粉碎成细粉，加入上述细粉，混匀，备用。

1.3 仪器及试剂

HIF-1α 定量试剂盒、Ang-1/Ang-2 定量试剂盒，荧光定量PCR 检测系统；紫外分光光度计；ST-2 转膜仪和MV-3 电泳仪；图像分析系统。

2 方法

2.1 急性心肌梗塞（AMI）模型的建立及分组方法

根据文献操作，具体参见文献[1]。

2.2 实验分组及给药

实验分5 组,每组各12 只，假手术组仅行冠脉穿线而不结扎。将60 只造模成功大鼠采用随机数字表法分为：模型组12只,造模后灌胃生理盐水10mL/(kg·d)；高剂量中药组12只,造模后灌胃中药0.99g/(kg·d),相当于成人临床用药等效剂量的2 倍；中药低剂量组12 只,造模后灌胃中药0.495g/(kg·d),相当于成人临床用药等效剂量；倍他乐克组12 只,造模后每日灌胃倍他乐克10mg/(kg·d)。各治疗组均于造模后24h 进行相应药物干预1 次/d,灌胃持续12d。

2.3 样本的取得、分离与制备

每组大鼠灌胃12d 后取9 只大鼠麻醉后剪开胸腹腔,分离心脏,在心肌坏死组织周边区剪取心肌约100mg,速放冻存管内,置液氮中保存备用。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 心肌梗死范围测定 参考文献[1]，将大鼠梗死心肌组织与未梗死心肌组织分别称重，以梗死心肌占左心室肌重量的百分比表示梗死范围。

2.4.2 实时PCR 法检测心肌HIF-1αmRNA 表达 样品总RNA的提取及纯化按试剂盒说明进行。

2.4.3 免疫组织化学测定Ang-1/Ang-2 蛋白表达 严格按照试剂盒要求进行。

3 结果

3.1 心肌梗死范围

表1显示，假手术组大鼠无心肌梗死。各治疗组梗死范围均明显小于模型组(P ＜0.05)，心肝同治高低剂量组明显优于消心痛组(P ＜0.05)，差异有统计学意义。

表1 心肝胃同治方对梗死范围的影响

3.2 对缺血心肌HIF-1αmRNA 表达的影响

表2显示，模型组HIF-1αmRNA 表达较假手术组增强(P＜0.05)；与模型组比较,倍他乐克组及高、低剂量中药组的HIF-1αmRNA 表达明显增加(P＜0.01),且高剂量中药组表达明显高于低剂量中药组(P＜0.05)。高剂量中药组HIF-1αmRNA表达与倍他乐克组相当,差异无统计学意义(P=0.062)。

表2 大鼠缺血心肌HIF-1αmRNA 的表达

3.3 大鼠缺血心肌Ang-1/Ang-2 蛋白表达的影响

模型组、心肝同治组方组及倍他乐克组的Ang-1/Ang-2蛋白表达在大鼠缺血心肌组织中较假手术组明显增高。心肝同治组方组及倍他乐克组的Ang-1 蛋白表达较模型组明显增高，而Ang-2 蛋白表达较模型组明显降低，心肝同治低剂量组与倍他乐克组两组间比较无明显差异；心肝同治高剂量组与倍他乐克组两组间比较有明显差异。

表1 大鼠缺血心肌Ang-1 蛋白的表达

表2 大鼠缺血心肌Ang-2 蛋白的表达

4 讨论

缺血心肌侧支循环建立的主要方式为微血管生成，血管内皮生长因子（VEGF）的表达受多种因子的调控,其中缺血或缺氧是诱导VEGF 表达的最主要因素[2],缺氧诱导因子-1（HIF-1）是VEGF 的转录活化因子[3],主要由HIF-1α 和HIF-1β 两个亚单位组成。激活的HIF-1 促使VEGF 和VEGF 受体表达增加,刺激缺氧组织建立有效的侧支循环并恢复内皮细胞的完整性,发挥自身搭桥作用,诱导新生血管形成[4～6]。

近年，国外研究提出“血管新生平衡学说”，即在正常的情况下，血管新生的诱导因子与抑制因子处于一种动态平衡状态，一旦微环境改变，此平衡被打破，就会激活诱导因子来促血管新生或抑制因子促血管退化。因此，可以说这两类因子的平衡状态决定了血管是否生长的状态。其中Ang-1和Ang-2 是最有效的血管新生调节因子[7]。Ang-2 通过结合Tie2 竞争性抑制Ang-1 的促Tie2 磷酸化作用，以破坏血管的稳定性，通过增加VEGF 的血管生成作用来促进肿瘤的生长，而Ang-1 作用与之相反[8]。研究表明Ang-1 有促进内皮细胞生芽、迁移、趋化和聚集，从而形成原始管状结构及维持并稳定血管的作用。而Ang-2 主要通过竞争性抑制Ang-1 形成不稳定渗漏性血管。因此Ang-1 与Ang-2 的平衡关系，决定着血管稳定或生长状态[9～11]。

冠心病心绞痛，中医称“胸痹（心痛）”，现已达成共识认为本病乃心气亏虚，心络与心肌失养，痰瘀互结，心络不通的本虚标实之证，其病位在心络，累及心肌。酿生心气亏虚、痰瘀互结之因，除与饮食失当、寒邪内侵、年老体虚等密切相关外，精神情志因素在本病的发生、发展过程中起着重要作用，所谓“七情之由作心痛”（沈金鳌《杂病源流犀烛·胃病源流》），七情中尤以肝失疏泄，条达失司最为关键。若肝气郁滞，疏泄无力，势必加重心气推动之力，“劳则气耗”，久之，则可致使心气亏虚，即“肝气滞则心气乏”，故而“心病先求于肝，乃清其源也”（《明医杂著·医论》）。清·陈士铎在《石室秘录·双治法》篇中亦极力倡导“心痛治肝”之法。

古文献中有以疏肝理气解郁立法治疗类似胸痹心痛证候的有效名方，如《太平圣惠方》的金铃子散、《圣剂总录》中郁金饮、《类证治裁》中的清郁汤、《医学心悟》的沉香降气散等。但以古方为基础，研制出体现疏肝理气解郁或心肝同治特色治疗冠心病心绞痛之专方却非常薄弱，而深入到分子水平研究其治疗机理者更少。故以古方为基础，研制出体现理气解郁治疗冠心病心绞痛之专方却是现代研究的薄弱环节。从肝治心组方由人参、柴胡、白芍、姜黄、熊胆等七味中药组成，体现“从肝治心，心肝并调”之治疗原则，肝能调气机、畅血脉，周学海《读医随笔》谓：“肝者，贯阴阳，统气血”，《素问·六节脏象论》曰：“肝者，魂之居也”，“以生血气”，我们认为，这一中医学理论可能是心肝同治法组方促血管新生的机制所在。

本实验应用冠状动脉结扎造成大鼠急性心肌缺血模型，观察缺血心肌梗死范围及HIF-1α、Ang-1/Ang-2 表达的变化。结果表明，实验结果显示，心肝同治方具有明确缩减心梗面积、诱导HIF-1α 表达增多、促进Ang-1 及抑制Ang-2 的表达，从实验角度验证了心肝同治理论的正确性,说明该方具有促血管新生，从而达到增加心脏侧支循环，保护心脏，延缓心肌缺血的作用。

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