Seipin基因缺陷诱发小鼠肾损害*

吴晓月， 王 欢， 刘雪静， 廖家葳， 张 玲， 刘国庆， 黄 薇

(北京大学医学部基础医学院心血管研究所， 北京 100191)

Seipin基因缺陷或者突变可导致先天性脂肪营养不良(congenital generalized lipodystrophy，CGL)[1]。它是一种常染色体隐性遗传性疾病，患者主要表现为全身脂肪组织的缺失，伴有肌肉增生、脂肪肝、胰岛素抵抗、心肌肥大等症状[2-3]。2004年Javor等[4]的研究发现，在25例CGL病人中，88%的病人出现尿蛋白排泄率升高，92%的病人出现肌酐清除率增高。这些病人肾脏病变主要为1型或者2型膜增生性肾小球肾病，也有部分患者表现为硬化性肾小球肾病或糖尿病性肾病。Seipin基因缺陷作为导致CGL疾病家族的一员，研究发现，45例患者中有7名在14～35岁时死亡，其中2例死于肾功能衰竭[5]。为了研究seipin基因缺陷是否能引起肾脏损害及可能机制，本实验利用我们研究组首次构建的seipin基因敲除(seipin-/-)小鼠，通过对尿白蛋白含量、肾脏功能及肾脏病理改变的研究，明确seipin基因缺陷能否引起肾损害，同时对可能机制进行初步探讨。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1动物 6月龄体重22～25 g的雄性seipin-/-小鼠及C57BL/6野生型(wild-type, WT)小鼠(北京大学医学部实验动物中心)，随机分为2组，每组8只。

1.2试剂和仪器 血糖测定试剂盒(中生北控);小鼠adiponectin和leptinELISA试剂盒(Millipore);小鼠insulinELISA试剂盒(上海依科赛生物)；RNA反转及实时定量PCR试剂盒(Promega);小鼠尿白蛋白(urinaryalbumin,UAlb)ELISA试剂盒(Bethyl);实时定量PCR仪(MIResearch);小鼠代谢笼(Tecniplast);图像分析软件(LeicaQWIN)。

2 方法

2.1Seipin-/-小鼠基因型鉴定 小鼠离乳后剪尾消化，进行DNA抽提，然后PCR基因型鉴定，引物序列为：loxP上游引物5’-CTTGTCTCAAAGGGGTCT-3’,下游引物5’-CAACAGAACAGACGCT-3’;PNRI上游引物5’-TCTATGGCTCCTTCTACTACTC-3’,下游引物5’-CGAATGATATGACGACGACT -3’。具体方法参照参考文献[6]。

2.2实时荧光定量PCR 取C57BL/6小鼠各组织(见图2)，其中肾脏分离肾皮质、肾髓质提取肾小球[7]。提取各组织总RNA，将其逆转录为cDNA后，以GAPDH为内参照，进行实时定量PCR检测基因表达水平[8]。Seipin上游引物5’-GGCTCCTTCTACTACTCCTACA-3’，下游引物5’-CCGATCACGTCCACTCTT-3’。

2.3肾脏相关指标检测 代谢笼留取24h尿，测24h尿肌酐和尿白蛋白；动物处死前称重及检测胫骨长，取右肾去包膜称重。肾脏于4% 多聚甲醛中固定，石蜡包埋，3μm切片。每个肾脏连续切片5张，过碘酸雪夫氏(PAS)染色后，随机选取100个肾小球，采用定量图像分析软件，计算肾小球表面积和肾基质表面积[9]。同时过碘酸六胺银染色(PASM)观察肾基质沉积，Masson染色观察肾纤维化情况。

2.4血浆生化指标检测 实验动物禁食4 h取血，离心后取血浆-20 ℃保存。血浆葡萄糖、胰岛素、脂联素及瘦素测定方法均按试剂盒说明书操作。葡萄糖耐量实验时，小鼠禁食4 h，腹腔注射20% 葡萄糖2 g/kg。分别在注射后0、15、30、60和120 min采血进行血糖测定。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理。数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，数据采用t检验统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Seipin-/-小鼠基因鉴定

将卵细胞特异性的Cre转基因动物与seipin基因第3外显子两侧带有loxP位点的动物进行杂交，得到seipin杂合子(seipin+/-)小鼠，纯合子是由杂合子互相交配获得[6]。野生型仅可扩增出1条300 bp 的带有loxP基因序列的条带，seipin-/-小鼠则仅能扩增出1条带有卵细胞Cre启动子PNRI位点的1 100 bp的条带,见图1。

Figure 1. Representation of genotyping results in seipin-/- mice; +/+: wild-type mice；+/-: seipin knockout heterozygote mice; -/-: seipin knockout homozygote mice.

2 WT小鼠各组织及肾脏各部位seipin mRNA的表达水平

Seipin mRNA在6个月C57BL/6小鼠中主要表达在睾丸及脂肪，肾脏中也有表达，但是水平较低，仅为睾丸及脂肪的10%～20%，见图2A。在肾脏中 seipin mRNA主要表达在肾皮质，表达量约为髓质的4倍，皮质中又主要在肾小球中表达量最高，见图2B。

Figure 2. Analysis of seipin mRNA expression levels in different tissues (A) and each part of the kidney (B) by qRT-PCR in C57BL/6 mice.WAT: white adipose tissue；BAT: brown adipose tissue; cortical: cortical substance of kidney; medulla: medulla of kidney.Mean±SEM.n=8.

3 Seipin-/-小鼠肾重、尿白蛋白及肌酐清除率检测

与WT小鼠相比，seipin-/-小鼠肾脏重量显著增加，但是肾重/体重比没有明显差异，这可能和小鼠seipin缺陷后肌肉增生，严重脂肪肝导致体重增加有关。因此我们使用肾重/胫骨长来修正动物间的个体差异，发现seipin-/-小鼠肾重/胫骨长明显高于对照组小鼠(P<0.01)。Seipin-/-小鼠24 h尿微量白蛋白(P<0.01)及肌酐清除率(P<0.01)均较WT小鼠明显增高，见表1。

表1 Seipin-/-和WT雄性小鼠6个月时体重、肾重、尿白蛋白及肌酐清除率的比较

*P<0.05，**P<0.01 vsWT.

4 Seipin-/-小鼠肾脏病理改变

PASM将富含IV型胶原的肾系膜基质、肾小球基底膜染成黑色。和WT小鼠相比，seipin-/-可见明显的肾小球系膜区增宽，系膜细胞和系膜基质增生，见图3A；D。PAS染色将基质染成红色，定量结果显示seipin-/-小鼠肾小球表面积明显增大(P<0.05)，见图3G；肾小球基质沉积增多(P<0.05)，见图3H。Masson染色没有发现seipin-/-小鼠出现明显的肾纤维化，见图3C、F。

5 Seipin-/-小鼠糖耐量、血浆胰岛素、瘦素和脂联素水平

Seipin-/-小鼠和WT小鼠相比，空腹血糖增高，糖耐量实验异常，血浆胰岛素含量显著增加(P<0.01)，提示seipin-/-小鼠有胰岛素抵抗。由于脂肪组织的缺失，和对照组小鼠相比，seipin-/-小鼠血浆瘦素(P<0.01)及脂联素(P<0.05)水平明显降低，见图4。

讨 论

Seipin是通过定位克隆的方法于2001年由Magre等[1]从 9个先天性全身脂肪营养不良的家系中筛选出来的，是一个2次跨膜蛋白，定位于内质网[10]。目前seipin的研究主要集中在脂肪细胞的分化、脂解及脂滴形成上[11-12]，关于它对肾脏的影响尚不明确。

我们首次发现将小鼠seipin基因敲除后，小鼠出现了明显的早期肾脏损伤，主要表现为24h尿白蛋白含量及肌酐清除率增高，肾小球肥大及肾小球基质沉积增多。通过检测seipinmRNA在全身各组织表达，我们发现其在睾丸及脂肪中表达量最高，在肾脏中可检测到较低水平的seipin表达，主要位于肾小球部位。

Figure 3. Renal morphology and quantitative analysis of glomerular surface area and mesangial surface area in seipin-/- mice (×400). A,D: renal PASM staining;B,E: PAS staining; C,F: Masson staining. A,B,C: WT mice; D,E,F: seipin-/- mice; G: quantification of glomerular surface area; H: mesangial surface area.Mean±SEM.n=8.*P<0.05 vs WT group.

Figure 4. Glucose tolerance (A), plasma insulin (B), leptin (C) and adiponectin (D) levels in seipin-/- and WT mice.Mean±SEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

Seipin缺失后表现为以脂肪缺失为主的全身代谢障碍[6]，我们在seipin-/-小鼠中发现由脂肪组织分泌的瘦素和脂联素在血浆中的含量降低，同时存在明显的胰岛素抵抗(图4)。

瘦素主要由血浆游离型发挥生理功能，参与机体能量代谢，抑制摄食，增加胰岛素敏感性。瘦素分泌不足、受体缺陷或瘦素抵抗导致的高瘦素血症可通过促进胰岛素抵抗、激活RAS系统、诱发氧化应激及免疫功能紊乱从而促进肾脏的损伤[13-14]。本实验发现seipin-/-小鼠有明显的肾损伤，可能与瘦素水平下降相关。另有研究表明，CGL病人用瘦素治疗后，可明显改善胰岛素抵抗及蛋白尿[15]，进一步证实了上述观点。

脂联素是脂肪组织分泌最多的因子。它可以通过NF-κB及TNF-α途径抑制炎症及保护内皮细胞，起到抗动脉粥样硬化和增加胰岛素敏感性等作用。脂联素的缺失，可导致小鼠出现尿白蛋白增高和肾脏纤维化等病变，与炎症及氧化增高相关[16]。本实验seipin-/-小鼠的肾损害与脂联素水平下降可能也有一定关系，但目前还没有用脂联素治疗改善CGL病人肾损伤的报道。

临床研究发现88%的CGL患者均有早期肾损害的表现[4]，也提示seipin基因缺陷导致的肾损害至少部分可能是由于脂肪组织缺失后，全身代谢障碍引起。

虽然seipin在肾脏中表达水平不高， 但seipin-/-小鼠的肾损伤除了与全身代谢障碍相关外，是否与肾局部seipin表达的缺失相关将是我们下一步要研究的内容。Seipin肾脏特异敲除小鼠将为我们解决这一问题。

综上所述，本研究首次发现seipin-/-小鼠出现明显的肾损伤，可能与全身脂肪缺失导致的瘦素和脂联素水平下降相关。

[参 考 文 献]

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