NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响*

吴炜景， 李 理， 徐采云， 黄文杰△

(1福建医科大学附属第二医院呼吸内科，福建 泉州 362000； 2广州军区广州总医院呼吸内科，广东 广州 510010)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPHoxidase，NOX/DUOX)家族是产生ROS的重要来源，是急性肺损伤过程中诱导产生细胞氧化应激的主要参与者。本实验室的前期研究表明，采用代表性的炎症因子TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞，可观察到放大的炎症反应和过度的氧化应激，造成细胞凋亡水平上升，细胞存活率下降[1-2]。因此，明确NOX/DUOX家族基因的表达机制，是炎症反应时调控其衍生的ROS维持在适当水平、减轻内源性氧化损伤的基础。在以高氧诱导的急性肺损伤小鼠模型中，NOX1在肺泡上皮细胞氧化损伤中的作用可能大于NOX2[3]。我们前期的研究提示NF-κB可能参与了TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤[2, 4]，我们推测其与NOX1的转录调控密切相关。鉴此，本研究采用生物信息学分析技术，获取NOX1基因近端启动子区NF-κB结合元件序列，通过构建相应的含NOX1启动子区及NF-κB结合元件缺失的启动子区萤光素酶重组载体，探讨该NF-κB对NOX1基因转录的调控作用。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

A549细胞由广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供，在含10%灭活小牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，2～3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2 主要试剂

RPMI-1640高糖培养基、胰酶和小牛血清购自HyClone；重组人TNF-α购自PeproTech; Lipofectamine 2000和Opti优化培养基购自Invitrogen；PCR试剂购自康为世纪公司；PCR引物由英骏公司合成；核酸marker DL2000、marker DL10000、琼脂糖、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自宝生物公司；pGL3萤光素酶报告基因载体、pRL-TK萤光素酶报告基因载体、双萤光素酶报告基因检测系统、T4 DNA ligase、KpnⅠ和HindⅢ购自Promega；大肠杆菌DH5α 由广州军区总医院医学实验科提供；胰化蛋白胨、酵母提取物和氨苄青霉素购自Sigma；DNA测序由华大基因研究院完成。

3 主要方法

3.1生物信息学分析 根据GenBand提供的NOX1基因DNA序列的CDS(GenBank Accession: NG_012567.1/GI:254939587)，确定翻译起始位点为ATG，将该位点定义为+1，提取其5’上游约1 500 bp的序列。登录http://www.gene-regulation.com，采用Alibaba 2.1软件分析上述序列，NOX1近端启动子区约1 500 bp范围内可预测到2个NF-κB结合元件。元件1称为NOX1/NF-κB1，位于-1 095～-1 086，核心序列为5’-CAGGAAAAC-3’；元件2称为NOX1/NF-κB2：位于-261～-252，核心序列为5’-TAAAATCCCC-3’，见图1。我们运用EMSA证实NOX1/NF-κB1不具有与TNF-α探针的结合活性(结果未列)，故将翻译起始位点上游-236至-323的序列作为缺失位点。

Figure 1. Identification of NF-κB responsive cis-acting elements in the proximal promoter of human NOX1 gene.

3.2重组载体构建 (1) 采用Primer Premier 5.0软件设计引物，用于扩增NOX1基因近端启动子区全段约1 415 bp，上游和下游引物分别引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点，序列及产物长度见表1，横线部分为KpnⅠ和HindⅢ酶切位点。(2) 采用上述软件设计用于扩增NOX1基因近端启动子区A段和B段的特异性引物，分别称为AF、AR和BF、BR。AF和BR端分别引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点，AR和BF含有重叠部分可将A段和B段连接，产物约1 327 bp，较全长片段缺少-236至-323的序列。引物序列及产物长度见表1。(3) PCR扩增NOX1基因近端启动子区全段、A段和B段： 按试剂盒说明书提取A549细胞基因组DNA，超微量分光光度计NanoDrop定量。反应体系：2×PCR Pre-Master Buffer 10 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 3.0 μL，dH2O 6.0 μL，total 20.0 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共40个循环，72 ℃ 10 min。(4)重叠PCR连接NOX1基因近端启动子区A段和B段并扩增A+B段：按试剂盒说明书将上述A段和B段的PCR扩增产物(分别为NOX1-A和NOX1-B)依次行电泳、回收、纯化。连接A段和B段的反应体系：2×PCR Pre-Master Buffer 10.0 μL，NOX1-A 1.5 μL，NOX1-B 1.5 μL，dH2O 12.0 μL，total 25.0 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共5个循环，72 ℃ 2 min，4 ℃ 10 min。扩增A+B段的反应体系：在上述反应产物中加入2×PCR Pre-Master Buffer 10.0 μL，Primer AF 0.5 μL，Primer BR 0.5 μL，dH2O 14.0 μL，总体系至50.0 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35个循环，72 ℃ 10 min。(5) 含NOX1近端启动子区的重组pGL3载体的构建：将NOX1基因近端启动子区全片段、A+B片段和pGL3空载体进行KpnⅠ和HindⅢ位点的双酶切、电泳及回收，获取纯化的目的片段和pGL3线性载体，分光光度计定量。以T4 DNA连接酶将目的片段与pGL3线性载体连接，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，涂板培养，摇菌并抽提质粒。将质粒进行双酶切、电泳初步鉴定，同时送华大基因研究院DNA测序、比对。比对正确的质粒分别命名为“全长载体pGL3-NOX1-1415”和 “缺失载体pGL3-NOX1-1327”。

表1 引物序列

3.3细胞萤光素酶活性测定 按照下法配制转染液：取pGL3重组质粒4.0μg和pRL-TK0.4μg加入到250μL的Opti优化培养基，室温静置5min；取Lipofectamine2000 10μL加入到250μLOpti优化培养基，室温静置5min；两者混匀，室温静置20min，用完全培养基稀释至1mL/well后再次静置20min即可用于转染实验。

将细胞分为a组：转染pGL3空质粒；b组：转染pGL3-NOX1-1415质粒；c组：转染pGL3-NOX1-1327质粒；将细胞以2×108/L接种于6孔板，待贴壁细胞的融合度达到50%，倾去培养基，将上述转染液加入细胞培养孔，继续培养6h后停止转染，倾去转染液，以PBS轻轻洗涤3次，瞬时转染结束，继续以含TNF-α(10μg/L)的无血清培养基刺激24h，收获细胞。按试剂盒说明书裂解细胞，Biocell多功能酶标仪先后测定萤火虫萤光素酶活性(记为A1)和海肾萤光素酶活性(记为A2)，A1/A2即为萤光素酶活性，表示插入启动子的活性。

4 统计学处理

应用SPSS 13.0软件包分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，所有数据均进行方差齐性检验。采用单因素方差分析进行组间均数比较，满足方差齐性的多重比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 重组质粒pGL3-NOX1-1415和pGL3-NOX1-1327的双酶切电泳结果

各片段PCR产物电泳结果如图2所示：a泳道为片段A，约1 100 bp；b泳道为片段B，约250 bp，c泳道为片段A+B，约1 300 bp；d泳道为全长片段，约1 400 bp。缺失片段A+B较全长片段电泳速度快，提示分子量稍小，缺失成功。

Figure 2. Electrophoresis image of different PCR products. Marker: DL2000； a: fragment A; b: fragment B; c: fragment A+B; d: NOX1 promoter.

全长载体pGL3-NOX1-1415双酶切产物电泳结果如图3所示：a泳道为全长片段；b泳道为空质粒pGL3；c泳道为质粒pGL3-NOX1-1415；d泳道为双酶切产物。位于泳道d的2条酶切产物分别与全长片段、空质粒pGL3处于同一水平，提示该载体确实由两者重组而成。

Figure 3. Electrophoresis image of pGL3-NOX1-1415. Marker: DL10000； a: NOX1 promoter; b: pGL3; c: pGL3-NOX1-1415; d: products of double digestion.

缺失载体pGL3-NOX1-1327双酶切产物电泳结果如图4所示：a泳道为缺失片段A+B；b泳道为空质粒pGL3；c泳道为质粒pGL3-NOX1-1327；d泳道为双酶切产物。位于泳道d的2条酶切产物分别与缺失片段A+B、空质粒pGL3处于同一水平，提示该载体确实由两者重组而成。

Figure 4. Electrophoresis image of pGL3-NOX1-1327. Marker: DL10000； a: fragment A+B; b: pGL3; c: pGL3-NOX1-1327; d: products of double digestion.

2 重组质粒pGL3-NOX1-1415和pGL3-NOX1-1327的测序结果的对比

2个重组质粒的测序结果分别经NCBI数据库比对，序列正确，载体构建成功。图5所示为核心序列对比，图5A为缺失载体pGL3-NOX1-1327，图5B为全长载体pGL3-NOX1-1415，蓝线所示为两者共有序列，红线所示即为缺失片段，图5A不含该序列，NF-κB结合元件缺失成功。

Figure 5. Sequence comparison of pGL3-NOX1-1415 and pGL3-NOX1-1327. A： pGL3-NOX1-1327; B： pGL3-NOX1-1415. The blue underline shows the same sequence of these 2 vectors. The red underline shows the deleted sequence.

3 细胞萤光素酶活性的比较

单因素方差分析结果显示，分别转染pGL3空质粒、pGL3-NOX1-1415质粒和pGL3-NOX1-1327质粒后，经TNF-α刺激的A549细胞萤光素酶活性的差异有统计学意义(P<0.01)。转染pGL3-NOX1-1415质粒和pGL3-NOX1-1327质粒的A549细胞萤光素酶活性较转染空质粒的A549细胞增强(85.500±3.619vs20.500±1.643, 61.500±3.782vs20.500±1.643)，差异有统计学意义(P<0.05)。转染缺失NF-κB结合元件的pGL3-NOX1-1327质粒细胞萤光素酶活性较转染pGL3-NOX1-1415质粒明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

Figure 6. The luciferase activity of the cells transfected with different plasmids.A: pGL3 group; B: pGL3-NOX1-1415 group； C: pGL3-NOX1-1327 group. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs A； #P<0.05 vs B.

讨 论

炎症反应及其诱发的氧化应激是ALI/ARDS重要的发病机制，针对ALI患者的肺组织保护策略，进行有效抗感染治疗的同时对机体免疫系统合理干预，将过度的炎症反应和氧化应激维持在适当水平，对于保持肺结构细胞完整性同等重要。明确氧化应激相关基因的表达机制，找到其调控靶点从而调节ALI氧化应激损伤，可能比单一补充细胞因子拮抗剂或抗氧化剂效果更好。

NOX1基因是NOX/DUOX家族的重要成员，是调控ALI时上皮细胞ROS生成的主要基因。本实验室前期研究中，以TNF-α刺激肺泡II型上皮细胞A549，观察到细胞上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及抑炎细胞因子IL-4、IL-10表达水平均上调，氧化物质活性氧、丙二醛生成增加，抗氧化物质超氧化物歧化酶、总谷胱甘肽消耗增多，提示炎症反应放大的同时诱发过度的氧化应激，且存在细胞凋亡水平上调的现象[1-2]。上述实验过程较好地模拟了急性肺损伤发生时II型上皮细胞的炎症环境。在该模型上，我们发现经TNF-α诱导的A549细胞NOX1基因与NF-κBp65基因表达上调趋势相同，提示NF-κB可能参与急性肺损伤过程中NOX1的转录调控。Lee等[5]指出小鼠巨噬细胞NOX1启动子区含有NF-κB结合位点，NF-κB可能是NOX1表达的关键转录因子，其调控作用具有细胞特异性。本研究进一步采用常用的生物信息学软件分析获得NOX1基因近端启动子的2个NF-κB结合元件，该结果与Manea等[6]预测的位点相似。该团队采用CHIP、荧光载体构建等技术证实，在TNF-α刺激的动脉平滑肌上皮细胞中，NF-κB与NOX1基因翻译起始位点上游-258～267区域结合，活化NOX1基因的转录。因此，本实验将包含该核心位点在内的翻译起始位点上游-236～-323区域作为缺失目的序列。

报告基因是用于研究启动子与转录因子相互作用的常用工具。pGL3质粒带有萤火虫萤光素酶的编码区，但不含启动子和增强子，将目的启动子片段插入该质粒，活化的转录因子与该启动子区结合可编码萤光素酶生成，通过检测萤光素酶的活性，可间接反应转录因子对该启动子的转录活性。本研究克隆NOX1近段启动子区约1 400 bp并插入该载体，构建含NOX1基因启动子全长片段的质粒pGL3-NOX1-1415，转染进入A549细胞后经TNF-α刺激24 h，可观察到其萤光素酶活性较转染空质粒显著升高，提示TNF-α刺激后NOX1基因表达明显增强。

NF-κB作为一种具有多向转录调节作用的核因子，广泛参与免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程，也是急性肺损伤发生、发展过程中炎症-氧化应激环路中重要的调控节点。TNF-α是ALI过程出现的促炎症细胞因子之一，能促发“瀑布式炎症级联反应”，活化其它细胞因子的释放过程[7]。研究表明，TNF-α可以通过与细胞膜上特异性受体TNFR1结合，激活“RIP1-MEKK3-TAK1-IKK”通路，使胞浆中无活性的NF-κB/I-κB二聚体解离；或者通过与TNFR2结合，募集可降解I-κB的细胞凋亡抑制因子cIAP-1 和cIAP-2，活化NF-κB的核转位。活化后的NF-κB在细胞核内与靶基因的启动子结合，调控其转录[8]。NF-κB的靶基因包括NOX2[9]、诱导型一氧化氮合酶[10]、环氧化酶2[11]、超氧化物歧化酶[12]、谷胱甘肽S转移酶[13]等促氧化和抗氧化相关基因。本研究预测NOX1为NF-κB的靶基因，并以TNF-α作为独立因素刺激A549细胞，模拟ALI诱发的细胞炎症-氧化损伤，将NF-κB结合元件的位置明确为翻译起始位点上游-236至-323的区域，核心序列位于-261 至 -252，为5’-TAAAATCCCC-3’。我们采用重叠延伸PCR技术，成功获得含NOX1近端启动子区部分片段缺失的“缺失载体”pGL3-NOX1-1327。同时荧光素酶检测结果显示，载体pGL3-NOX1-1327启动子区活性较pGL3-NOX1-1415明显下调，这提示-236～323区域(NF-κB结合元件所在区域)含有可被转录因子结合并活化的有效元件；缺少该片段的NOX1基因启动子活性降低。

综上，本研究应用载体构建技术和重叠延伸PCR技术，成功构建含NOX1启动子全长片段的pGL3-NOX1-1415及缺失了该启动子区的有活性NF-κB结合元件的pGL3-NOX1-1327，为后续NOX1基因启动子区的研究奠定了分子生物学基础。缺失NF-κB元件的NOX1基因启动子区转录活性下调，提示在TNF-α诱导肺泡上皮细胞炎症反应继发的氧化应激损伤中，NF-κB参与了NOX1基因转录调控，其具体的结合位点及活性有待后续的实验中运用EMSA、ChIP等技术，从蛋白-DNA结合的角度进一步验证。探讨NF-κB对NOX1的调控机制有助于我们了解急性肺损伤发生时以TNF-α为代表的炎症因子诱发的结构细胞氧化应激损伤机制，为急性肺损伤在基因层面的诊治研究奠定基础。

[参 考 文 献]

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