多发性骨髓瘤应用荧光原位杂交检测基因异常的价值

李文兵,李显东

(湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

多发性骨髓瘤应用荧光原位杂交检测基因异常的价值

李文兵,李显东

(湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

目的 探讨应用荧光原位杂交检测法检测多发性骨髓瘤基因异常的价值，进一步分析临床分期及免疫学分型特点。方法 选择40例多发性骨髓瘤患者，对RB1、1q21、p53、D13S319以及IGH 5种基因行荧光原位杂交检测，分析p53缺失、RB1缺失、1q21 扩增及IGH基因的重排发生情况，并统计处理基因异常与免疫学分型以及临床分期的关系。结果 RB1、1q21、p53、D13S319及IGH 5种基因的阳性阈值分别为8.6%，7.2%，7.2%，7.9%和9.7%，40例患者中1q21 扩增23例(58%)，同时检测出RB1缺失以及D13S319缺失14例(35%)，p53缺失9例(22%)，IGH基因重排15例(38%)。临床D-S分期与IGH重排有显著相关性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期与p53缺失有显著相关性(r=-0.449，P=0.005)，免疫学分型与D13S319缺失有显著相关性(r=-0.341，P=0.040)，其余几种基因异常均无显著相关性。结论 多发性骨髓瘤较为常见的基因异常主要为p53缺失、RB1 缺失、1q21 扩增及IGH基因的重排，应用荧光原位杂交检测能够较好地分析基因异常与多发性骨髓瘤的关联性以及预后，值得临床予以广泛性推广应用。

多发性骨髓瘤；荧光原位杂交；基因异常；检测率

多发性骨髓瘤(MM)主要特征为骨髓克隆性浆细胞异常积累，同时伴随有恶性增殖，在血液肿瘤中约占10%[1-2]，MM易出现基因异常，发生率较高，同时有独立的预后判断意义，临床常用的传统方法即细胞遗传学检测，其对基因异常的检测率仅占患者的1/3[3-4]，而随着医学技术的发展，目前使用的荧光原位杂交检测法，则可以全面对细胞进行分析，避免了传统细胞遗传学检测的缺陷，提高了基因异常的检测率。笔者对40例多发性骨髓瘤患者应用荧光原位杂交检测，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2012年3月—2013年12月本院收治的多发性骨髓瘤患者40例，其中男25例，女15例；年龄37～81(61.8±2.1)岁。多发性骨髓瘤的诊断依据2008年中国多发性骨髓瘤工作组制定的《中国多发性骨髓瘤诊治指南》中相关标准[5]。临床分期主要为ISS分期与DS分期，其中ISS分期中Ⅰ期 8 例，Ⅱ期16例，Ⅲ期16例；DS分期中Ⅰ期 7 例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例。免疫学分型IgG 型 21例，轻链型6例，不分泌型4例，IgA 型9例。选择同期非血液系统恶性疾病患者16例作为对照组，其中男10例，女6例；年龄25～66(58.3±1.6)岁。2组患者在年龄、性别等基础资料比较无显著性差异(P均>0.05)。2组患者均签署参与本试验知情书，并经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 探针 本文所用荧光原位杂交检测试剂盒均出自北京金菩嘉生物公司，其中含有序列特异性探针 1q21，主要针对1q21 区带，此外还含有序列特异性探针RB1即(视网膜神经胶质瘤基因)以及D13S319，主要针对13q14 区带，还含有序列特异性探针IGH以及探针p53，分别针对14q32 区带与17p13 区带，对探针做好标记，并保存，保存温度-20 ℃。

1.2.2 处理标本 将新鲜的骨髓均匀涂片，不要过厚，晾干后，行56 ℃烤片处理，处理时间为10～20 min，再应用100%的甲醇浸泡约5 min，使用浓度100%的乙酸浸泡处理30 min，室温下使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，随后老化玻片约60 min，或者在室温下过夜老化玻片，老化好的玻片先后置入37 ℃的RNaseA溶液以及盐酸胃酶溶液中，孵育时间分别为30 min与10 min，再行使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，随后在-20 ℃下依次置入到浓度分别为70%，100%和85%的乙醇中行梯度脱水，时间约2 min，晾干后加热到56℃，行杂交试验。

1.2.3 原位杂交 探针的配置要在暗室内依照检测试剂盒的操作进行，在70 ℃下，应用浓度70%的甲酰胺变性6 min，随后置入50 ℃环境下保存备用，行老化处理后的玻片可以放置在73 ℃下，使用70%的甲酰胺变性6 min，随后在-20℃下依次置入到浓度分别为70%，100%和85%的乙醇中行梯度脱水，时间约3 min，晾干后，再置入50 ℃烤片机上行预热处理约5 min，随后可将经变性后的10 μL 探针滴加入杂交区，加盖盖玻片防止气泡，在42 ℃下，密封后过夜，杂交后将玻片置于甲酰胺溶液，2×SSC溶液中洗涤后，于室温下，置入浓度70%的乙醇中浸泡3 min，在晾干后行DAPI复染再行封片。

1.4 统计学处理 本研究所用统计学软件为SPSS 17.0，对研究中的计数资料行2检验，使用Spearman相关系数分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 涉及探针的阳性阀值 16例非血液系统恶性疾病患者，其骨髓样本间期核细胞各个探针阳性细胞表达率见表1。

表1 5种基因探针杂交信号阳性阀值 %

2.2 全部患者探针异常表达情况 经Spearman 相关分析，p53缺失与lq21 扩增呈正相关(r=0.356,P=0.034)；RB1缺失及D13S319缺失呈正相关(r=0.855，P=0.001)。见表2。

表2 5种基因探针杂交信号阳性阀值 例(%)

2.3 基因异常与免疫分型及分期情况 基因异常与免疫学分型及临床分期关系，其中D-S分期与IGH重排有相关性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期与p53缺失有相关性(r=-0.449，P=0.005)，免疫学分型与D13S319缺失有相关性(r=-0.341，P=0.040)。其余基因异常与ISS分期以及D-S分期无显著相关性，且与免疫学分型无明显相关性。

3 讨 论

在早期研究中，对多发性骨髓瘤的分子细胞遗传学以及细胞遗传学分析，几乎全部的多发性骨髓瘤均有克隆性基因异常[6-7]，多为复杂核型异常，最为常见的是1，13，14及17号染色体的数目或者结构异常。本研究中，分别选择了5种特异性探针，为IGH、D13S319、p53、RB1以及1q21，检测后得出异常表达率较高的RB1缺失、1q21扩增、p53缺失以及IGH重排。研究结果表明，多发性骨髓瘤患者，其RB1 缺失、1q21 扩增、D13S319 缺失、p53 缺失及IGH重排的检出率分别为35.0%，57.5%，35.0%，22.5%和37.5%，其中1q21 扩增发生率最高，再者为p53 缺失，82.5%患者均存在基因异常，且复杂核型异常约占60%，因为应用传统的细胞遗传学检测，结果显阳性患者仅占1/3。因此使用荧光原位杂交检测较传统方法更加具备优势，可以显著提高核型异常的检出率，同时证实多发性骨髓瘤的核型异常多数为复杂核型异常。

1q21区域存在与多发性骨髓瘤是联系紧密的基因簇，其中主要包括IL-6受体基因，多发性骨髓瘤会因IL-6受累，而导致IL-6的数目基因量的效性大量增加，促使骨髓中的浆细胞增殖分泌出较多的β2-MG，预后以及生存期均较差[8-9]。此外，在1q21区域中还存在CKSlB 基因，其属于Cks/Sucl 蛋白，可通过p27K-与Skp2的依赖与非依赖机制促使多发性骨髓瘤细胞有所增殖，其也成为了多发性骨髓瘤的预后不良因素。

刘珊珊等[10]报道1q21扩增的发生率为57.5%，与国外研究相比较高，但与国内的研究报道几乎一致，可见国内多发性骨髓瘤患者的1q21扩增发生比率较高。

而RB1与D13S319是检测13q14 缺失的主要相关部位，13q14 缺失也在多发性骨髓瘤中有着重要的作用，是反应生存期较短的一个重要指标，尤其是并血清β2-MG水平升高的患者，由结果表明，RB1缺失的检出率为35%，但RB1缺失与1q21 扩增不具有正相关性，且研究发现，p53 缺失也并不是多发性骨髓瘤的特有基因异常，p53 缺失在多发性骨髓瘤的检出率为22%，且与ISS分期呈现负相关性(r=-0.449，P=0.005)，由此可见，p53 缺失是多发性骨髓瘤中较少的继发事件，多发生在ISS期，通过Spearman相关性分析，p53缺失与1q21 扩增呈正相关(r=0.356,P=0.034)，与相关报道几乎一致[11]。可见p53缺失与1q21 扩增会共同参与到激活血管新生级联反应，增加了骨髓微环境中的微循环血量，这也是造成多发性骨髓瘤发病的重要机制。

本研究D13S319缺失的检出率是35%，与相关报道比较稍低[12]，证实了免疫学分型与D13S319缺失有相关性(r=-0.341，P=0.040)，而IGH检出率为38%，其与临床分期D-S分期呈现正相关(r=0.425，P=0.001)。在本研究中，D-S分期Ⅰ期多发性骨髓瘤患者，3/7的患者可表达IGH重排异常，由此说明IGH重排是多发性骨髓瘤基因异常的一个早期提示事件。

综上所述，p53缺失、RB1 缺失、1q21 扩增及IGH基因的重排是多发性骨髓瘤常见的复杂核型异常，前三者是反应多发性骨髓瘤发展以及预后的不良因素，应用荧光原位杂交检测是一种较好的方法，可作为评估多发性骨髓瘤的常规检查方法，值得临床予以大量推广使用。

[1] 杨璐璐，聂玉，刘欣，等. 免疫组织化学联合荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤分子细胞遗传学异常[J/CD]. 中华临床医师杂志:电子版，2013，7(8):3345-3350

[2] 杨瑞芳，李春溟，陈丽娟，等. 荧光原位杂交技术检测MM分子遗传学改变及其意义[J]. 中华医学遗传学杂志，2010，27(5)：567-570

[3] 钟山，余英豪，黄红浪，等. 荧光原位杂交法对胃癌组织 HER2 基因状态的检测[J]. 世界华人消化杂志，2011，19(2):132-137

[4] 王迪，黄亮，张恒，等. FICTION 技术在检测多发性骨髓瘤遗传学异常中的应用[J]. 中华血液学杂志，2011，32(4)：226-230

[5] 唐元艳，梁艳，熊涛，等. 荧光原位杂交技术与常规染色体分析检测骨髓增生异常综合征患者+ 8和20q -异常[J]. 临床荟萃，2012，27(9):761-763

[6] 周丽颖,贾婵维,余兰,等. 荧光原位杂交技术在染色体异常中的应用研究[J]. 中国优生与遗传杂志,2010,1(4):46-47

[7] Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008: an overview[J]. Pathologica，2010，102(3):83-87

[8] 宋国新，李红芬，李霄，等. 荧光原位杂交与免疫组织化学检测胃癌组织中HER2基因及蛋白表达一致性[J]. 临床与实验病理学杂志，2012，28(10):1094-1097

[9] Kawankar N，Rao Vundinti B. Cytogenetic abnormalities in myelodysplasticsyndrome: an overview[J]. Hematology，2011，16(3):131-138

[10] 刘姗姗，彭忠异. HER2 基因在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 实用癌症杂志，2012，27(4):339-342

[11] Birerdinc A，Nohelty E，Marakhonov A，et al. Pro-apoptotic andantiproliferative activity of human KCNRG，a putative tumor suppressor in13q14 region[J]. Tumor Biol，2010，31(1)：33-45

[12] 胡林萍，葛菁，张丽艳，等. 用于荧光原位杂交技术的骨髓细胞制片方法研究[J]. 中国实验血液学杂志，2012，20(2)：496-499

The value of detection of multiple myeloma using fluorescence in situ hybridization gene abnormality

Li Wenbing， Li Xiandong

(Taihe Hospital Afflicted to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to approach the value of detection by fluorescence in situ hybridization method for multiple myeloma gene abnormality, and further analyzes the characteristics of clinical staging and immunological classification.Methods 40 patients with multiple myeloma were selected to test 5 genes including RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH by fluorescence in situ hybridization, the information of p53 deletion, RB1deletion, amplification of 1q21 gene, and IGH rearrangement were analyzed, and the relationships of abnormal gene with immunological typing and clinical staging of contact were statistics.Results Positive values of RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH were 8.6%, 7.2%, 7.2%, 7.9% and 9.7%. Among 40 patients, 23 cases (58%) were amplified by 1q21, At the same time, detection showed that the deletions of RB1 and D13S319 in 14 cases (35%), 9 cases (22%) of p53 deletion, 15 cases (38%) of IGH gene rearrangement. There were significant correlation between clinical D-S stage and IGH rearrangement (r=0.425,P=0.001), ISS stage and p53 deletion (r=-0.449,P=0.005), immunological classification and D13S319 deletion (r=-0.341,P=0.040).Conclusion For multiple myeloma, the common genetic abnormalities are p53 deletion, RB1 deletion, 1q21 amplification and IGH gene rearrangement. The application of fluorescence in situ hybridization can preferably analyze gene abnormalities and multiple myeloma associated and prognosis, and is worthy of wide popularization and application to clinical.

multiple myeloma; fluorescence in situ hybridization; gene abnormality; detection rate

李文兵，男，主管技师，研究方向为临床检验。

李显东，QQ：564494691

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.010

R733.3

A

1008-8849(2014)15-1624-03

2013-12-30