西兰花多肽组分II诱导神经胶质瘤细胞凋亡的作用及其机制研究*

齐 玲， 徐俊杰， 赵东海， 韩 磊， 纪朋艳， 王玮瑶， 吕士杰

(吉林医药学院，吉林 吉林132013)

多肽是由10～100个氨基酸分子经脱水缩合而成的化合物，它在生物界中的存在十分广泛。多肽除了具有营养、调节机体的代谢和生理功能外[1-2]，还可以作为药物来发挥作用。多肽药物具有活性高、用量小和易产业化等优点，现已成为药物研发的热点之一。西兰花是具有明确抗癌特性的食物，它因含有多种营养成分而被称为“营养素的宝库”。研究表明，西兰花中的维生素、多酚类和黄酮类物质具有明确的抗氧化活性，硫代葡萄糖苷则能降低癌症的患病风险[3-4]，而硫苷的水解产物异硫氰酸盐具有明确的抗癌作用[5]，但关于西兰花多肽成分抗癌的研究较少。本实验在以往工作的基础上，将西兰花多肽提取物经凝胶过滤层析分离获得4个主要洗脱峰，取其中第II峰即西兰花多肽组分II(CII)多肽含量最高的洗脱物用于后续实验研究[6]。本实验进一步研究西兰花中多肽组分II对神经胶质瘤的作用及可能的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞株 人神经胶质瘤SHG-44细胞株，由吉林大学基础医学院提供。

1.2主要试剂 RPMI-1640细胞培养基 (HyClone)；0.25%胰蛋白酶和小牛血清(Gibco)；四甲基偶氮唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；西兰花多肽组分II(冻干粉，吉林医药学院制备)；免疫组化试剂盒(北京中杉公司)；β-actin、Bax、Bcl-2和caspase-3 抗体(Santa Cruz)。

1.3主要仪器 CB150型CO2培养箱(Binder);J-26XP型超低温高速离心机(贝克曼)；MDF-U53V型超低温冰箱(三洋)；PLUS 384型全自动酶标仪(MDC)；IX-70型倒置显微镜(Olympus)；DNA蛋白电泳系统(Bio-Rad)；Image-Pro Plus 图像分析管理系统 (Media Cybernetics)。

2 方法

2.1细胞培养 预热含10%小牛血清的RPMI-1640培养液。从液氮罐中取出神经胶质瘤SHG-44细胞株，迅速置于37 ℃水浴振荡至融化，离心后弃上清，将细胞用1 mL培养液轻轻混匀，将含细胞的培养液吸出后放入培养瓶中，再加入9 mL新鲜的培养液，轻轻混匀后置入5% CO2、37 ℃培养箱中，饱和湿度下进行培养。待细胞密度达80%～90% 汇合时，按1∶2进行传代。

2.2MTT分析细胞活性 取适量西兰花多肽组分II，将其配制成终浓度分别为3、10、30和100 mg/L的含药培养液。基础培养液为含5%小牛血清的RPMI-1640培养液。将SHG-44细胞消化后，以8×103cells/well的密度均匀种于96孔板中，置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。在24 h、48 h和72 h时分别加入含药和不含药的培养液，每个浓度重复5次。作用结束时，每孔加入MTT 20 μL，继续孵育4 h终止培养，弃上清后，每孔加入150 μL DMSO，15 min后在酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)，以时间为横坐标，A值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.3细胞凋亡率的检测 将SHG-44细胞按每孔2×105细胞接种于6 孔板，4个实验组均加入西兰花多肽组分II，使其终浓度分别为3、10、30和100 mg/L，空白对照组加入基础培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h，收集细胞，PBS 洗涤2 次。按照说明书操作，用1∶4 binding buffer 缓冲液190μL 重悬细胞，调整细胞浓度为(2～5)×108/L，然后加入FITC标记的Annexin V-FITC 5 μL和20 mg/L PI 10 μL，冰浴10 min，流式细胞术检测每个样品中每10 000个细胞中细胞的凋亡率。

2.4细胞凋亡的形态学观察 将SHG-44细胞以5 000 cells/well的密度接种于24孔板中培养过夜，次日加入西兰花多肽组分II(3、10、30和100 mg/L)，设空白对照组，加药后继续培养72 h，取出培养板后在倒置显微镜下观察并拍照。

2.5免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白 将SHG-44细胞按5 000 cells/well的密度接种于置有玻片的24孔板中，实验设空白对照组和西兰花多肽组分II(3、10、30和100 mg/L)组，均作用72 h，玻片固定，灭活封闭，Ⅰ抗过夜，Ⅱ抗室温孵育2 h，DAB显色，脱水和透明后封片。每组各取3张切片，随机选择3个不同视野，应用Image-Pro Plus分析软件分析蛋白阳性产物的积分吸光度值，取平均值做统计分析。

2.6Western blotting法检测凋亡相关蛋白的表达 将SHG-44细胞以1×108/L密度接种于25 cm2培养瓶中。分别加入西兰花多肽组分II，使其终浓度为3、10、30和100 mg/L，空白对照组加入基础培养基，均作用72 h。收集细胞，PBS洗涤细胞后用50 μL细胞裂解液裂解细胞。提取蛋白后测定浓度，SDS-PAGE分离蛋白，转膜封闭，加入β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3 抗体，4 ℃孵育过夜。Ⅱ抗室温孵育1 h，胶片曝光拍照。实验结果采用Image-Pro Plus图像分析软件进行分析，以特异性条带平均吸光度与面积的乘积来反映蛋白的表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 西兰花多肽组分II对SHG-44细胞活性的影响

MTT结果显示，24 h时，100 mg/L 西兰花多肽组分II组SHG-44细胞活性降低(P<0.05)；48h时，10、30和100 mg/L西兰花多肽组分II组SHG-44细胞活性均降低(P<0.05)；72 h时，西兰花多肽组分II各浓度组SHG-44细胞活性均下降(P<0.01)。并且，西兰花多肽组分II对细胞活性的影响呈现时间-剂量效应关系，见图1。根据MTT结果，不同浓度的西兰花多肽组分II作用SHG-44细胞后72 h时作用最为明显，因此选取72 h作为后续实验的时间。

2 SHG-44细胞凋亡率的变化

3、10、30和100 mg/L西兰花多肽组分II 作用于SHG-44细胞72 h后，Annexin V/PI分析各用药组凋亡率分别为(15.34±2.48)%、(19.64±3.35)%、(40.38±5.29)%和(63.21±3.17)%，各组凋亡率均明显高于同期空白对照组(1.81±0.74)%，30和100 mg/L组较对照组差异有统计学意义(P<0. 05)，各用药组的凋亡率随着药物剂量的增加而显著升高，见图2。

Figure 1. Effect of component Ⅱ (CⅡ) of broccoli polypeptide on the viability of SHG-44 cells. Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 mg/L.

Figure 2. Effects of component II (CⅡ) of broccoli polypeptide on apoptosis of SHG-44 glioma cells.

3 SHG-44细胞凋亡的形态学变化

倒置显微镜下观察，西兰花多肽组分II(0、3、10、30和100 mg/L)作用于SHG-44细胞72 h后，对照组生长良好，各用药组随浓度升高细胞数量明显减少，以100 mg/L西兰花多肽组分II组最为明显，镜下可见到明显的凋亡小体，见图3。

Figure 3. Apoptotic morphology of SHG-44 cells was observed after treated with component II of broccoli polypeptide (×200).A: control group; B: 100 mg/L group.

4 SHG-44细胞凋亡相关蛋白的变化

免疫细胞化学结果显示，3、10、30和100 mg/L西兰花多肽组分II作用于SHG-44细胞72 h后，细胞Bax蛋白表达逐渐增加，Bcl-2蛋白表达逐渐减少，与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；计算Bax/Bcl-2的比值发现，随着药物浓度升高，Bax/Bcl-2比值明显升高，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图4。

Figure 4. Expression of Bax and Bcl-2 proteins in SHG-44 cells after treated with component Ⅱ (CⅡ) of broccoli polypeptide (×200). Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs 0 mg/L.

Western blotting结果显示：3、10、30和100 mg/L西兰花多肽组分II作用于SHG-44细胞72 h后，细胞表达Bax蛋白呈上升趋势，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；细胞表达Bcl-2蛋白减少，与对照组比较，各药物组差异均具有统计学意义(P<0.01)。检测细胞caspase-3蛋白表达发现，各药物组细胞表达量均增加，与空白对照组比较，30和100 mg/L西兰花多肽组分II组差异有统计学意义(P<0.01)。计算Bax/Bcl-2比值发现，与空白对照组比较，各药物组比值均明显增加(P<0.05或P<0.01)，见图5。

讨 论

神经胶质瘤是颅内肿瘤的最常见类型，它具有发病率、复发率、死亡率高而治愈率低的“三高一低”的特点。由于神经胶质瘤发生于颅内，它对人的生命和健康的威胁极大[6]。神经胶质瘤一经诊断，首选手术疗法，术后再尽早辅以放、化疗或联合替莫唑胺等疗法。结合手术和放化疗方法，患者的中位生存率也仅达14.6个月[7]。因此，如何延长神经胶质瘤患者的生存时间，提高患者的生存质量是目前胶质瘤治疗的难点。有研究发现，恶性神经胶质瘤细胞由于激活了细胞的生长途径和/或抑制细胞的凋亡途径而对治疗产生抵抗[8]。

多肽分为人工合成多肽和生物活性多肽两种，它具有多种用途，可以应用于多个领域，因此，开发多肽产品具有广泛的市场前景。西兰花是著名的抗癌食物之一，在此前研究中，本实验组提取西兰花多肽成分，得到4个组分，其中以组分Ⅱ的生物活性最高[9]，并发现其可以抑制胶质瘤细胞的增殖。本研究进一步研究西兰花多肽组分II在不同剂量时对神经胶质瘤细胞的作用，发现西兰花多肽组分II作用SHG-44细胞24 h、48 h 和72 h均可以明显地降低细胞活力，72 h时细胞活性降低最为明显。以上结果说明，西兰花多肽组分II作用不同胶质瘤细胞后随着作用时间及剂量的增加，细胞活性降低更加明显，药物作用具有时间-剂量效应关系。

肿瘤细胞的生长受抑制可能是由于细胞凋亡或增殖受抑制所引起。因此，我们应用Annexin V/PI 检测细胞的凋亡率结果发现，3、10、30和100 mg/L西兰花多肽组分II均可以诱导SHG-44细胞发生凋亡，并且随着剂量的增加，凋亡率亦明显增加。进一步观察SHG-44细胞凋亡的形态学变化发现，西兰花多肽组分II作用于SHG-44细胞后，细胞密度随药物浓度升高而明显减少，并可见到明显的凋亡小体，100 mg/L西兰花多肽组分II浓度组最多。以上结果说明，西兰花多肽组分II在作用细胞后可以通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的生长，作用具有剂量依赖性。

在药物促使细胞发生凋亡过程中，凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的量和两者比值往往决定了细胞是否容易发生凋亡。Bax是最常见的促凋亡相关蛋白之一，细胞在受到凋亡因子刺激时，Bax等会在线粒体膜上进行同源寡聚，使线粒体膜上的大孔通道开放，从而使细胞色素C等线粒体蛋白释放到胞质中，促使凋亡发生[10-12]。本实验中免疫细胞化学和Western blotting方法结果显示细胞表达Bax蛋白逐渐增加，表达Bcl-2蛋白逐渐减少，并且随着药物浓度升高，Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.01)。以上结果表明，西兰花多肽组分II可以促进凋亡相关蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，使Bax/Bcl-2比值增加。

Caspase-3是凋亡途径下游主要的效应因子，是凋亡的具体执行者。当凋亡发生时，caspase-3活性片段表达量会增加[13-14]。Western blotting检测caspase-3蛋白的表达显示，各用药组细胞caspase-3蛋白活性片段表达量均增加，尤其是30和100 mg/L西兰花多肽组分II组作用明显(P<0.01)。这一结果表明，西兰花多肽组分II促进SHG-44细胞caspase-3蛋白的活化，使凋亡得以发生。

总之，西兰花多肽组分II通过促进神经胶质瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的生长，这可能是通过药物作用后，促进肿瘤细胞促凋亡蛋白Bax和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，使Bax/Bcl-2比值明显增加，再通过线粒体途径的激活使caspase-3蛋白活化增加，进而促进肿瘤细胞凋亡。但更深一步的机制，还需在今后的实验中继续研究。

[参 考 文 献]

[1] Klompong V, Benjakul S, Yachai M, et al. Amino acid composition and antioxidative peptides from protein hydro-lysates of yellow stripe trevally (Selaroidesleptolepis)[J]. J Food Sci, 2009, 74(2):126-133.

[2] 李鸿梅. 玉米功能肽的制备及其生理活性的研究[D]. 长春:吉林大学, 2008.

[3] Jeffery EH, Brown AF, Kurilich AC, et al. Variation in content of bioactive components in broccoli[J]. J Food Compos Anal, 2003, 16(3):323-330.

[4] Zareba G, Serradell N. Chemoprotective effects of broccoli and other Brassica vegetables[J]. Drug Future, 2004, 29(11): 1097-1104.

[5] 邹 翔, 郎 朗, 武晓丹, 等. 西兰花中葡萄糖异硫氰酸盐诱导人胃腺癌SGC-7901 细胞凋亡的初步研究[J]. 中草药, 2006, 38(2):228-231.

[6] 曹志友, 金 宏, 田 晶, 等. 白附子提取物对胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制[J]. 吉林大学学报：医学版, 2013, 39(4):649-652.

[7] Stupp R, Warren P, Martin J, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med, 2005, 352(10):987-996.

[8] Qi L, Bellail AC, Rossi MR, et al. Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis[J]. Apoptosis, 2011, 16(11):1150-1164.

[9] 徐俊杰, 于洪泉, 赵 伟, 等. 西兰花多肽对C6胶质瘤细胞的诱导凋亡作用[J]. 吉林大学学报：医学版, 2013, 39(1):8-11.

[10] Szegezdi E, MacDonald DC, Ní Chonqhaile T, et al. Bcl-2 family on guard at the ER[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2009, 296(5):C941-C953.

[11] 周开宇, 毛天明, 陈 茜, 等. 苦参碱对人髓母细胞瘤 D341 细胞凋亡及相关蛋白表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(4): 629-634.

[12] 李 军, 王国荣, 张秀芹, 等. 二苯乙烯苷对同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞凋亡及 Bcl-2、Bax 和caspase- 3 表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(4):743-747.

[13] Devi DG, Cibin TR, Abraham A. Bis (3,5-diiodo-2,4,6-trihydroxyphenyl) squaraine photodynamic therapy inducesinvivotumor ablation by triggering cytochrome c dependent mitochondria mediated apoptosis[J]. Photodiagnosis Photodyn Ther, 2013， 10(4):510-517.

[14] 钟 越, 齐 玲, 沈 楠, 等. 越桔原花青素调控脑胶质瘤细胞生长的机制研究[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(4):603-608.