A型禽偏肺病毒F蛋白的原核表达与抗原性分析

阎 旭，韦 莉，王 菁，朱姗姗，张春燕，柳舒航，全 荣，李子璇，刘 浩，刘 爵

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 塘沽 300457；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀 100097）

禽偏肺病毒病(Avian metapneumovirus，aMPV)是指由偏禽肺病毒引起的一种以禽呼吸道症状、头部肿胀和产蛋率下降为主要特征的疾病。禽偏肺病毒又称火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，感染火鸡后可引起温和或中度上呼吸道感染-火鸡鼻气管炎(TRT)；也可引起鸡的温和型上呼吸道或中枢神经系统疾病-肿头综合征(SHS)。禽偏肺病毒属于副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属，于1978年首次发现于南非共和国,随后从法国、英国、中国台湾、日本等国家和地区的呼吸道疾病或SHS发病鸡中分离到aMPV。1998年沈瑞忠[1]等人在我国黑龙江某肉鸡场的SHS鸡群中分离到了APV/Chick⁃en/China/1/98株。

1997年，在美国科罗拉多州首次分离到与欧洲等一些国家报道的毒株不同的aMPV，命名为aMPVC。根据吸附糖蛋白G蛋白核苷酸序列分析和单克隆抗体中和试验，aMPV分为A、B、C、D四个亚型。aMPV-A和aMPV-B主要分布在欧洲和南非，aMPVC感染以美国为主，aMPV-D仅在法国可检测到。通过特异性单克隆抗体中和试验检测表明，aMPV-C与aMPV-A、aMPV-B之间没有明显的血清学关系。一般情况下，aMPV-A和aMPV-B之间蛋白结构的同源性为70%～90%，二者与aMPV-C之间的同源性则为40%～70%，而aMPV-C与hMPV之间的蛋白结构比其他亚型更相似。

禽偏肺病毒是一种不分节段的单股负链RNA病毒，病毒粒子具有多形性，一般呈椭圆形，偶尔也有圆形或长线状形，直径80～300 nm，核衣壳大小约为15 nm，有囊膜，表面纤突长约13～15 nm[2]。aMPV共有8种结构蛋白，3种膜蛋白[3-5]，即融合蛋白F、小疏水蛋白SH和糖蛋白G，其中F蛋白诱导与病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，又称为融合蛋白。病毒包膜与细胞质膜的融合是把核衣壳传递到细胞质中，随后感染细胞，在感染的细胞质膜中表达的F蛋白可以介导与邻近细胞质融合形成合胞体[6-7]，合胞体可能是病毒传播的机制。F蛋白为I型膜蛋白，编码540～580个氨基酸，研究表明，F蛋白是偏肺病毒宿主嗜性的主要决定因素[14]。本试验的目的是利用可溶性的大肠杆菌系统表达aMPV F基因，为今后的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种、酶类及其他试剂 Pcmv-myc-L质粒本实验室保存；pBCX载体谢青梅博士惠赠。基因工程宿主菌E.coli DH5α，TaKaRa公司购买；表达菌E.coli BL21（DE3）博迈德生物公司购买。PrimeSTAR HS DNA Polymerase，购自 TaKaRa公司；Trans2K DNA Marker，购自Transgen公司；快速凝胶回收试剂盒和小量质粒DNA提取纯化试剂盒，购自Omega公司；限制性内切酶HindⅢ、Kpn I和磷酸酶抑制剂，购自NEB公司；QIAquick PCR Purification Kit，购自Qiagen公司；T4 DNA连接酶，购自Fermentas公司；IPTG、Amp、溴化乙锭（EB），购自宝泰克生物科技有限公司；6×His-Tag融合蛋白亲和层析Ni-NTA凝胶，购自德国Qiagen公司。

1.2 F基因的扩增、回收 根据GenBank上发表的A型aMPV F蛋白基因序列，用Oligo 6.0软件设计一对特异性引物(F1/F2)，F1：5′-GG GGTACC GAG⁃GCAGTATCCACATTAGGG-3′，F2：5′-CCC AAGCTT CTTGGCATCTGCACCTAG-3′。其扩增片段长度为1023 bp，以Pcmy-myc-L作为模板取0.2μL，加入上下游引物F1、F2各1μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，5×Buffer4μL，Prime STAR 0.2μL，加ddH20至20μL。PCR反应循环程序如下：95℃预变性5 min，94℃30 s，59℃1.5 min，循环35次，最后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，OMEGA公司快速凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.3 重组质粒的构建与鉴定 回收的F基因经HindⅢ和KpnⅠ酶切，克隆至pBCX载体中，构建pBCX/AMV/A/F。将其转化入感受态BL21（DE3）中，鉴定为阳性的单菌落，加入终浓度分别为0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG进行诱导表达，确定最适诱导条件。

1.4 目的蛋白的可溶性分析、纯化及鉴定 参照确定的最适诱导条件，IPTG诱导表达4 h，离心收集菌体冰浴条件下超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。按照Qiagen纯化蛋白试剂盒说明，在非变性的条件下，将1000 mL经IPTG诱导4 h后的菌液，取菌体裂解、离心，将上清通过Ni-NTA柱，收集洗脱液，并测蛋白浓度。将纯化所得蛋白分别进行SDS-PAGE电泳和WB。常规制备样品，12%SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移至NC膜上，封闭NC膜，PBST洗膜3次，加入1∶800稀释的一抗溶液，室温孵育2 h，PBST液洗膜3次，放人1∶8000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗中，室温孵育1.5 h，PBST液洗膜3次，每次10 min。把NC膜浸入到配好的底物溶液中显色，出现颜色时，立刻用蒸馏水冲洗终止反应，拍照。

2 结果

2.1 F基因的PCR扩增结果 用所设计的F1/F2引物进行PCR扩增，从Pcmy-myc-L质粒中扩增的PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳时，可以见到长约1023 bp左右的电泳条带，大小与预期的相吻合（图1）。

图1 F基因的PCR扩增

2.2 重组质粒的酶切与PCR鉴定结果 挑取转化后的单菌落进行PCR鉴定，扩增到长约1023 bp的片段（图2）。aMPV-F基因PCR产物经纯化酶切后，插入pBCX载体的外源基因插入位点，构成重组质粒pBCX-F（图3）。

图2 单菌落PC R鉴定

图3 重组质粒酶切鉴定

2.3 SDS-PAGE分析结果 取菌液接种到LA液体培养基中，37℃220 r/min离心振摇培养，待细菌浓度达到OD600为0.4～0.5时加入IPTG并使其终浓度达1 mmol/mL，取不同小时诱导的菌液进行SDS-PAGE检测，表达产物如图4所示，直接将融合蛋白细菌裂解上清用QIAGEN NI纯化柱纯化，在Clution Buffer洗脱液中含有目的融合蛋白，如图5所示。

图4 融合蛋白表达产物的S D S-PA G E检测

图5 融合蛋白纯化S D S检测

图6 表达重组蛋白的W estern-blotting鉴定

2.4 Western-blotting分析结果 经SDS-PAGE电泳，利用Western-blotting对纯化的aMPV F融合蛋白进行特异性鉴定。结果在预定的74 kDa上方处有一条较深的显色带，说明重组F蛋白具有抗原活性，大小与SDS-PAGE表达的蛋白大小一致。该结果证实了用载体pBCX表达的融合蛋白F均具有免疫活性。

3 讨论

目前我国是世界上第一养鸡大国，鸡的饲养量96亿只，每年因各类禽病带来的死亡率高达20%～25%，损失数百亿人民币。因此，研制特异、灵敏、简便的诊断试剂盒是我国当前防控疫病的迫切需求。在众多的表达系统之中，大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的经典表达系统，具有结构简单、易操作、成本低廉的优点。本试验进行了A型aMPV F基因在大肠杆菌系统中的表达，所选取的表达载体pBCX是pet-43.1载体插入了msyB基因作为融合伴侣的改造载体，msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高可溶性多肽，本身在大肠杆菌中表达量很高，其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性；pBCX载体有6×His融合标签，有肠激酶的裂解位点，便于检测和纯化所表达的重组融合蛋白，本试验表达的F蛋白具有免疫原性，可以直接作为免疫原免疫动物，也可以纯化之后免疫动物，或与佐剂配合之后免疫动物。为了减少免疫的副作用，也可以用肠激酶处理该融合蛋白，将目标蛋白与伴侣蛋白裂解，收集、纯化目标蛋白，用目标蛋白作为抗原免疫动物。

本试验仅是初步探索了aMPV F基因在大肠杆菌中的表达情况，为更加深入地研究aMPV F基因的功能及其他重组蛋白的表达提供了参考，aMPV F基因在大肠杆菌中的成功表达为aMPV诊断抗原及基因工程疫苗的研制奠定了基础。

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