广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染情况调查

魏晓瑞，陶 立，李 军，谢永平，闭炳芬，陈泽祥，韦志锋，秦若甫，兰美益，彭 昊，杨 威，王晓丽

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；3.广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西 南宁 530001）

自Tyzzer（1907）首次发现小鼠隐孢子虫（C.muris）以来，国内外学者对隐孢子虫病进行了大量研究，已在人、哺乳动物、禽类、爬行动物和鱼类等多种动物中发现15个种类的隐孢子虫感染[1-3]，其中可感染牛的隐孢子虫种为安氏隐孢子虫（C.an⁃dersoni）、小球隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、小鼠隐孢子虫(C.muris)、犬隐孢子虫(C.ca⁃nis)、猫隐孢子虫(C.fells)、猪隐孢子虫(C.suis)、鹿样基因型（C.deer-like genotype）和赖氏隐孢子虫（C.ryanae）[4-5]。隐孢子虫对牛的感染与牛的年龄呈正相关性[6]。本实验室对广西奶牛隐孢子虫病流行病学的调查结果显示，广西奶牛感染的隐孢子虫种类为安氏隐孢子虫，由于调查的时间错过了产犊高峰期，对2月龄内犊牛的调查样本数相对偏少，有可能造成漏检[7]。为了更能全面准确地反映广西奶牛隐孢子虫感染的种类和流行情况，本实验室在2011年9月至2012年1月采用醛-酯法预处理粪样，再经饱和糖溶液漂浮、抗酸染色法和PCR鉴定检测了广西7个黑白花奶牛场2月龄内犊牛隐孢子虫感染状况。

1 材料与方法

1.1 材料 待检粪样： 采集7个广西黑白花奶牛场617头2月龄以内犊牛的新鲜粪便，每头粪样10～30 g左右，分装于洁净的塑料袋内，编号和标记牛的日龄及自然状况，置4℃冰箱待检。

主要试剂及配制：乙酸乙酯溶液、10%福尔马林溶液、饱和蔗糖溶液（食用白糖500 g，蒸馏水350 mL，石炭酸7.0 mL，比重为1.28）。改良抗酸染色液分别是甲液（碱性复红4 g，95%酒精20 mL，石碳酸8 mL，蒸馏水100 mL）、乙液（硫酸10 mL，蒸馏水90 mL）、丙液（0.2 g孔雀绿溶于蒸馏水100 mL）。甲醇，2.5%重铬酸钾溶液。PCR Taq Mix、DNA Marker1，购自广州东盛生物科技有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

主要仪器：PCR仪，购自TaKaRa公司；凝胶成像系统，购自Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 犊牛粪样处理和饱和蔗糖液漂浮 取每份粪样5～10 g，加适量10%福尔马林溶液，充分捣碎、搅匀，60目铜筛过滤，滤液再经260目尼龙筛过滤，将滤液置离心管中，3000 r/min离心10 min，弃上清液后，在沉淀中加入5倍体积以上的10%福尔马林溶液充分混匀，再加入福尔马林溶液2/5体积的乙酸乙酯溶液充分混匀，3000 r/min离心10 min，弃上清。沉淀中加入约3/4试管体积的蒸馏水充分混匀，3000 r/min离心10 min，弃上清。最后在沉淀中加适量的饱和蔗糖溶液，搅匀后3000 r/min离心10 min。用铁丝环蘸取表层液膜制片，于400×镜下观察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取1.2.1的沉淀物涂片，自然干燥，甲醇固定5 min，滴加甲液于粪膜上，5～10 min后水洗；滴加乙液，1～5 min后水洗；滴加丙液，1 min后水洗，晾干后1000×油镜下观察。

1.2.3 卵囊形态学鉴定 每张玻片观察100个视野，在400×镜下测量卵囊的大小，根据卵囊的长短径计算卵囊指数，观察卵囊的形态结构。

1.2.4 PCR鉴定 取阳性粪样200 mg，应用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便DNA进行隐孢子虫的种类鉴定[8]。

2 结果

2.1 广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染情况 共调查7个黑白花奶牛场，检测粪样617头份，其中6个场为隐孢子虫感染阳性场，共检出阳性粪样57头份，场均感染阳性率为9.24%（表1），隐孢子虫卵囊的检出与犊奶牛的年龄呈一定的相关性（图1）。

2.2 虫种鉴定

图1 隐孢子虫感染与犊牛日龄的关系

2.2.1 卵囊形态和大小 粪样经醛—酯法和饱和蔗糖溶液漂浮法处理后，用铁丝环蘸取粪样的表层液膜制片，于400×镜下观察发现隐孢子虫卵囊呈粉红色，椭圆形或圆形，囊壁薄而光滑，周围有淡绿色光圈，无微孔和极粒，内有月牙形的子孢子。经改良抗酸染色法处理的样品，在1000×油镜下观察，蓝绿色的背景上卵囊呈鲜艳的玫瑰红色，卵囊为椭圆形或圆形，囊内有月牙形的空泡，但多数卵囊内部结构不清楚（图2）。卵囊大小为6.26μm～8.38μm×4.20 μm～5.35μm，平均7.48μm×5.23μm，卵囊形状指数（长/宽）1.07～1.60，平均为 1.36（n=100）。

图2 隐孢子虫卵囊（改良抗酸染色法） （1000×）

2.2.2 PCR鉴定 应用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便DNA进行隐孢子虫的种类鉴定，结果表明检测到的隐孢子虫均为安氏隐孢子虫（图3）。

图3 PCR基因分型

3 讨论

对广西7个黑白花奶牛场的617头份2月龄内犊牛粪样检测发现，广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染率为9.24%，57份阳性粪样检测到的卵囊形态学相近或一致，经PCR鉴定证实为安氏隐孢子虫，这和我们之前调查相一致[7]，说明安氏隐孢子虫是感染广西黑白花奶牛隐孢子虫的主要种类。

研究表明，小球隐孢子虫是感染犊牛的主要隐孢子虫虫种，其感染高峰期为1-15日龄，21-60日龄奶牛感染的虫种60%～90%为小球隐孢子虫，其余为牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫和鹿样基因型，3-11月龄仅见牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫和鹿样基因型的感染，而无小球隐孢子虫感染[6-9]；Wang等(2000)也认为小球隐孢子虫主要寄生于断奶前犊牛，牛隐孢子虫和赖氏隐孢子虫主要寄生于断奶后犊牛和青年牛，安氏隐孢子虫常见于成年牛[5]。我们的调查表明，目前广西2月龄犊牛感染的隐孢子虫种类为安氏隐孢子虫，是否还有小球隐孢子虫的感染还有待深入调查。

2月龄内犊牛由于还没有断奶，粪便中含脂质较多，黏稠不易被水洗开，即使用饱和蔗糖溶液漂浮也会因脂质颗粒无法观察到卵囊，用醛-酯法处理粪样可解决粪便中脂质的问题，大大地提高了检出率。

检测发现F场的阳性率特别高，达到34.0%。这与该场犊牛混群饲养、拥挤和环境卫生极差有关，粪尿横流极易污染饲料和水源，导致犊牛的重复感染。因此，一定要注意犊牛的饲养管理，按日龄大小分群，保持合理的饲养密度和空间，及时清除粪便、清扫场地，搞好环境卫生。

[1]Ryan U M，Monisp，Enemark H L，et al.Suis n sp(Apicomplexa:Cryptosporididae)in pigs(Susscrofa)[J].J Parasitol，2004，90(4):769-773.

[2]Fayer R，Santin M，Xiao L.Cryptosporidium bovis n sp(Apicom⁃plexa:Cryptosporididae)in cattle(Bos taurus)[J].J P arasitol，2005，91(3):624-629.

[3]Xiao L，Fayer R，Ryan U M，et al.Cryptosporidiumtaxonomy:re⁃centadvances and implications for public health[J].Clin Microbi⁃ol Rev，2004，17:72-97.

[4]梁楠，菅复春，宁长申，等.牛隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展[J].中国兽医科学，2006，36（12）：1024-1030.

[5]Wang R，Ma G，Zhao J，et al.Cryptosporidium andersoni is the predominantspecies in pose-weaned and adult dairy cattle in Chi⁃na[J].Parasitol Int，2011，60(1):1-4.

[6]Wade S E，Mohammed H O，Schaaf S L.Prevalence of Giardia sp，Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium muris(C.andersoni)in 109 dairy herds in five counties of southeasten New York[J].Vet Parasitol，2000，93(1):1-11.

[7]陶立，陈泽祥，韦志锋，等.广西奶牛隐孢子虫病的流行病学调查[J].中国兽医科学，2012，42（7）：742-746.

[8]彭昊，李军，陶立，等.牛隐孢子虫多重PCR方法的建立及应用[J].中国人兽共患病学报，2012，28(8):825-828.

[9]Santin M，Trout J M，Xiao Li，et al.Prevalence and age related variation of Cryptosporidium species and genotypes in dairy calves[J].Vet Parasitol，2004，122（2）:103-117.