江苏安徽地区鹅源沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

査 华，石火英，尚 竟，晋海云，刘 伊，王 婉

（扬州大学兽医学院病理教研室禽类预防医学教育部重点实验室，江苏 扬州 225009）

沙门菌是一种对人和动物都非常重要的致病菌，它不但可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎，还可以作为食源性疾病的病原体，引起人类胃肠炎和食物中毒[1,2]。禽源沙门菌是严重危害我国禽业的重要传染病，可造成种蛋孵化率、雏禽存活率和禽生产性能下降等问题[3]。鸡白痢沙门菌是禽源沙门菌中的一种，在各种年龄鸡只都可发病。抗生素是防治鸡白痢重要措施，但抗生素的滥用造成了鸡白痢沙门菌的耐药性逐年上升[4-,5]。虽有文献报道鹅源沙门菌诊断和防治，但针对鹅源沙门菌的实验室诊断、分型和耐药性分析却较为罕见[6]。本研究对2012年6月-2013年1月江苏、安徽地区的532份鹅源病料、泄殖腔棉拭子进行了沙门菌的分离，并对鉴定出的15株鹅源沙门菌进行血清型分型及药物敏感性试验，以期对鹅源沙门菌新近分离株的流行分布及耐药性提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 扬州大学动物医院来源的江苏、安徽地区鹅源病料，汇集江苏、安徽地区鹅的扬州市活禽市场所采集的鹅泄殖腔棉拭子。

1.2 质控菌株及主要试剂 药敏试验大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922，由实验室保存。沙门菌属诊断血清(60种)，购自兰州生物制品研究所；PCR相关试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司；亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，麦康凯培养基、S.S.培养基（沙门、志贺氏菌属琼脂培养基），购自上海生工生物工程技术服务有限公司；肠杆菌科细菌生化鉴定管及成套试剂，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 药敏纸片 头孢曲松（30μg），四环素（30 μg），壮观霉素（100μg），头孢西丁（30μg），链霉素（10μg），氯霉素（30μg），头孢孟多（30μg），卡那霉素（30μg），复方新诺明（23.75μg），磺胺异噁唑（300μg），羧苄青霉素（100μg），庆大霉素（10 μg），甲氧苄啶（5μg），萘啶酸（30μg），氨苄西林（10μg），头孢噻肟（30μg），环丙沙星（5μg），阿莫西林-克拉维酸（20μg）等18种药敏纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 细菌分离、纯化及革兰染色 以常规无菌操作方法剖检病死鸡，取病料、泄殖腔样品置于SC肉汤中，37℃摇床增菌18～24 h；转接于麦康凯培养基，置于37℃培养箱培养18～48 h，挑取可疑菌落于S.S.及麦康凯培养基进行分离纯化。将纯化菌直接涂片，按革兰染色程序（草酸铵结晶紫液1 min，碘液1min，95%酒精15～30 s，沙黄复染液1 min）操作后，在光学显微镜下观察菌体形态。

1.5 PCR鉴定沙门菌属 针对沙门菌肠毒素STN基因设计引物，上游引物 P1：5′-CTTTGGTCGTA⁃AAATAAGGCG-3′，下游引物P2：5′-TGCCCAAAG CAGAGAGATTC-3′[7]。PCR体系为25 μL，模板为纯化后的疑似沙门菌单菌落提取的DNA。扩增程序为94℃ 5 min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1 min，25个循环；72℃10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 生化试验鉴定沙门菌 PCR鉴定为阳性的分离株，进行硫化氢、苯丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖等15种生化指标的测定。

1.7 血清学分型 对STN基因扩增为阳性、生化试验符合沙门菌特性的分离株，再次纯化，涂布于LB培养基，按照中华人民共和国国家标准GB 4 789.4～2010，进行血清型鉴定[8]。

O抗原鉴定：用A-F多价O血清进行玻板凝集实验，同时设以生理盐水对照。生理盐水不凝集而O多价血清凝集者，用O9；O4；O10；O7；O8；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。

H抗原鉴定：生理盐水对照为阴性者，进行H多价1、H多价2、H多价3、H多价4血清进行鉴定，对于阳性者，再用对应的H复合血清及H单因子血清逐一检查，以确定H第一相及第二相H抗原。每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

1.8 药物敏感性试验 对鉴定出的鹅源沙门菌分离株，通过琼脂纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B)进行头孢曲松、四环素、壮观霉素、头孢西丁等18种抗菌药物的敏感性试验，以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株，按CLSI2009版的标准进行结果判定[9]。

1.9 动物试验 筛选2株所分离沙门菌优势菌（鸡白痢沙门菌）S1084和S1088，对1日龄SPF雏鸡进行致死性试验，腹腔注射200μL/只（约含菌量1×109CFU），每组10只，并设置阴性对照组，注射后观察2周，记录死亡情况，并剖检死亡鸡只，取肝、脾在麦康凯培养基、S.S.培养基进行细菌分离，37℃培养18～48 h，观察菌落形态并用O9单因子血清进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 分离菌培养特性与形态特征 病料接种后，可见在麦康凯培养基均形成无色、半透明、边缘整齐、光滑型圆形小菌落；在S.S.培养基形成白色或中心带黑色的边缘整齐、光滑、圆形小菌落；革兰染色镜检可观察到散在排列的红色短小杆菌，符合沙门菌的特征。

2.2 PCR鉴定结果 在初步分离的疑似沙门菌中，采用针对沙门菌肠毒素STN基因的引物进行PCR扩增，其中有15个分离株基因组DNA中能够扩增出约260 bp DNA片段，与沙门菌预期扩增结果一致，表明所分离菌中有15株为沙门菌。

2.3 生化试验 分离株能产生硫化氢，利用木糖、鸟氨酸、赖氨酸、M.R.、葡萄糖产气、山梨醇，而其余指标如V-P、动力、侧金盏花醇等为阴性。

2.4 血清型鉴定 经血清型鉴定，所分离15株沙门菌中，10株为鸡白痢沙门菌，2株为德尔卑沙门菌，1株为汤卜逊沙门菌，1株为鼠伤寒沙门菌，1株为里吉尔沙门菌。沙门菌分布情况如表1。

表1 鹅源沙门菌分离株的分布情况

2.5 药物敏感性试验结果 所鉴定15个鹅源沙门菌分离株的18种抗菌药物的药物敏感性试验结果显示，分离株对萘啶酸全部耐药，对羧苄青霉素、氨苄西林、链霉素和磺胺异噁唑也具有很高的耐药性，耐药率分别为93.33%、86.67%、80%和80%；而对头孢曲松、头孢西丁和卡那霉素耐药性较低，各抗菌药物分布菌数及所占比例见表2。除个别分离株耐药性较低外，86.67%的分离株为多重耐药菌，且多为7耐菌和8耐菌，表型为TETSTR-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX和STR-CE-SULCAR-NAL-AMP-AMX，8耐分离株表型分别为TET-STR-CE-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX、SPTSTR-SXT-SUL-CAR-TMP-NAL-AMP和STR-CECAR-TMP-NAL-AMP-CTX-AMX；甚至出现14耐和15耐的高度耐药菌，分离株表型见表3。

2.6 致死性试验结果 1日龄雏鸡接种S1084和S1088后24 h内即出现死亡，其余死亡鸡分布在攻毒后6 d内，而在7～14 d期间未见鸡死亡，所攻毒鸡的死亡总数分别为10只和8只，阴性对照组鸡生长健康。剖检死亡雏鸡，并进行肝和脾的沙门菌分离，在麦康凯和S.S.培养基所培养细菌均符合沙门菌菌落形态，O9血清鉴定纯化后细菌，都为强阳性凝集，且健康组鸡肝、脾内未分离到细菌，表明攻毒组确为鸡白痢沙门菌感染，进而说明鹅源鸡白痢沙门菌对雏鸡具有很高的致病性。

表2 鹅源沙门菌抗菌药物分布菌数及所占比例统计

表3 鹅源沙门菌的耐药表型

3 讨论

禽源沙门菌是危害我国养禽业的重要传染病病原，给家禽养殖和蛋类生产带来严重的经济损失。目前沙门菌防治以抗生素治疗和生物防控为主，但部分地区抗生素的滥用也造成了禽源沙门菌耐药性的上升。近年来，有报道沙门菌的流行病学和耐药监测，但针对鹅源沙门菌的流行、亚型分布和耐药监测却比较少见[6,10]。本研究通过分子生物学方法与传统方法结合，对鹅源病料、棉拭子进行沙门菌的分离鉴定和多重耐药性分析，共鉴定新近鹅源沙门菌15株，阳性率为2.82%，分布于B群、C1群和D群，其中鸡白痢沙门菌占多数（66.67%）。药敏结果显示，分离株对萘啶酸全部耐药，对羧苄青霉素、氨苄西林、链霉素和磺胺异噁唑耐药性也很强，由于动物源的沙门菌耐药机制将会影响人类健康，因此，兽医临床工作者应控制抗菌药物的使用和用量。在全部鹅源沙门菌中，86.67%的分离株为多重耐药性菌，且耐药性很强，甚至出现15耐的罕见多重耐药菌（为德尔卑沙门菌）。值得注意的是，所有鹅源鸡白痢沙门菌耐药性在7耐及7耐以上，其水平传播很可能使鸡具有很高的耐药性和致病性，既而对养鸡业的雏鸡繁殖和蛋类生产造成重大经济损失，故建议进行鸡和鹅的分群饲养，并对鹅源鸡白痢沙门菌进行长期的耐药监测。

［1］ NeSBITT A，Ravel A，Murry R，et al.Integrated surveillance and potential sources of Salmonella Enteritidis in human cases in Canada from 2003 to 2009[J].Epidemiol Infect，2012，140(10)：1757-1772.

［2］ Severi E，Booth L，Johnson S，etal.Large outbreak of Salmonel⁃la Enteritidis PT8 in Portsmouth，U K，associated with a restau⁃rant[J].Epidemiol Infect，2011，14：1-9.

［3］ Bao H，Zhang H，Wang R.Isolation and characterization of bac⁃teriophages of Salmonella enterica serovar Pullorum[J].Poult Sci,2011,90(10)：2370-2377.

［4］ Threlfall E J，Fisher IS，Berghold C，et al.Antimicrobial drug resistance in isolates of Salmonella enterica from cases of salmo⁃ nellosis in humans in Europe in 2000： results of international multicentre surveillance[J]. Euro Surveill，2003，8(2)：41-45.

［5］ Pan ZM，Wang X Q，Zhang XM，etal.Changes in antimicrobi⁃al resistance among Salmonella enterica subspecies enterica se⁃rovar Pullorum isolates in China from 1962 to 2007[J].Veteri⁃nary Microbiology，2009，136(3-4)：387-392.

［6］ 金海林，赵权.鹅沙门菌病的诊断与防治[J].中国兽医杂志，2012，48(2)：87-88.

［7］ 刘蓓蓓.沙门菌PCR检测方法的建立及其初步应用[D].扬州：扬州大学，2009.

［8］ Popoff M，Le Minor L.Antigenic formulas of the Salmonella se⁃rovars，WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella[z].World Health Organ，2001.

［9］ Clinical and Laboratory Standard Institute.Performance stan⁃dards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S].Nineteenth In⁃formational Supplement，2009：M100-S19.

［10］孙化露，姜逸，李树纯，等.动物源性沙门菌的血清型、生物被膜形成能力和耐药性分析[J].畜牧兽医学报，2012，43(10)：1630-1638.