复方中药-益生菌生物控制剂的研制及其对断奶仔猪的影响

席 磊 ，郑 鸣，王永芬，边传周

（河南牧业经济学院，河南 郑州 450011）

猪致病性大肠杆菌是兽医学临床感染中最常见的病原菌之一，抗生素在该病防治中的长期使用和滥用，产生的耐药性、药物残留、动物自身免疫力降低以及对生态环境潜在危害等弊端日趋明显[1-2]。益生菌、中药作为新型的绿色饲料添加剂，以天然无毒、无副作用、无残留等优势，正在成为抗生素的替代品，受到养殖业青睐，是净化养殖场环境，实现可持续发展的必然选择[3-6]。目前市售中药、益生菌产品，存在以下问题：一是缺乏针对特定猪场或区域病原菌开展优势益生菌株与高效中药筛选；二是产品多采用单一菌株、单方中药或复合菌株、复方中药等形式，对两者协同使用产品开发较少；三是产品应用停留在疾病防治层面，没有考虑到菌株多重耐药性逆转与环境净化问题。通过质粒消除作用实现菌株耐药性逆转，是目前解决菌株耐药性的研究热点[7]。研究表明，不少中药在其抗菌消炎的基础上，还有消除细菌耐药性质粒的作用[8]。

本试验在前期针对87株猪致病性大肠杆菌开展的不同生物制剂对其抑菌效果、不同中药对其耐药性质粒消除作用等试验基础上[1，8]，以石榴皮、黄芩、黄连等3种中药和乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌等2株益生菌为材料，制备复方中药-益生菌生物控制剂，在断奶仔猪中进行应用研究，旨在为利用生物制剂控制猪大肠杆菌病发生、实现菌株耐药性逆转提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 益生菌、中药 黄连、黄芪、石榴皮，购自郑州中药批发市场；乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌，由河南牧业经济学院微生物实验室提供。

1.2 培养基 营养琼脂、普通肉汤、LB等培养基，均购自北京奥博星生物技术责任有限公司。

1.3 抗菌药标准品 诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、四环素(TC)、复方新诺明(SXT)、强力霉素(DOX)、氨苄西林(AM)、链霉素(SM)等 7 种药敏纸片，购自北京天坛生物技术有限公司；药敏试验质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.4 主要仪器 中药多功能提取罐：上海达程试验设备有限公司；BMR系列中试发酵罐(50 L)，上海傲中生物工程设备有限公司；核酸电泳系统：上海禾工科学仪器有限公司；Enduro GDS凝胶成像系统：美国Labnet公司。

1.5 复方中药煎剂的制备 将石榴皮、黄芩、黄连等3种中药按刘玉庆等[9]方法，以2∶3∶5比例,采用煎煮法提取，使药液中生药含量均为1 g/mL，灭菌，4℃保存备用。

1.6 复方益生菌制剂的制备 按王永芬等文献[10]方法，分别制备乳酸杆菌与枯草芽孢杆菌制剂，1∶1混合制备复合益生菌制剂4℃保存。用稀释平板法检测产品活菌数(CFU/g)。

1.7 复方中药-益生菌生物控制剂对断奶仔猪生长性能与腹泻预防效果

1.7.1 试验动物的选取与饲喂 选择日龄相同、体重相近的19日龄健康三元杂交仔猪16窝，编号依次为1～16，每4窝为1组，随机分为4组。依次为对照组（CK）、试验1组（复方中药制剂组）、试验2组（复方益生菌制剂组）、试验3组（复方中药-益生菌生物控制剂组）。在常规日粮基础上，各试验组采用湿拌料，复方中药制剂10mL/kg、复方益生菌制剂10 g/kg，每日添加3次。添加时间为19～28日龄。对照组、试验组均按猪场常规饲养管理方式饲养，断奶时间为28日龄。

1.7.2 试验地点与观察时间 试验在河南安阳某猪场进行，观察时间从19日龄开始到42日龄。

1.7.3 测定指标 仔猪日增重、料重比、腹泻率、腹泻频率和死亡率。其中腹泻率（%）=腹泻头数/总头数×100；腹泻频率（%）=Σ(腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数)/(供试猪总头数×试验天数)×100。血清免疫指标测定，分别在19日龄、28日龄、35日龄和42日龄，每组随机选取5头仔猪采血，用IgG非特异性抗体试剂盒进行检测。

1.8 猪场环境中致病性大肠杆菌耐药性质粒消除与耐药性逆转的测定 19、28、42日龄分别在各组圈栏内各采集5个粪样，分离致病性大肠杆菌，进行耐药性试验、耐药性质粒提取检测，比较不同阶段菌株耐药性与所含质粒数量。

1.9 猪粪中氨气释放量的测定 19、28、42日龄分别在各组圈栏内各采集5个粪样，按照李万军等[11]方法测定氨气释放量。

1.10 数据处理 用SPSSV19.0对试验数据进行处理和统计分析，进行F检验，并用Duncan′s法多重比较。

2 结果与分析

2.1 复方益生菌制剂活菌数的检测 经检测制备的乳酸杆菌益生菌制剂、枯草芽孢杆菌益生菌制剂、乳酸杆菌-枯草芽孢杆菌复合益生菌制剂中的活菌数分别为8.29×108、6.79×109、8.97×108CFU/g。

2.2 复方中药-益生菌生物制剂对断奶仔猪生长性能与腹泻预防效果

2.2.1 对断奶仔猪生产性能与腹泻预防的影响由表1可知，试验各组日增重显著高于对照组（P＜0.05），料重比、腹泻率、腹泻频率均显著低于对照组（P＜0.05）。试验3组日增重较试验1组、2组分别提高23.03%（P＜0.05）和 20.65%（P＜0.05）；料重比分别下降21.46%（P＜0.05）和18.10%（P＜0.05）；腹泻频率分别下降65.23%、54.12%（P＜0.05）。说明复方中药-益生菌生物控制剂对断奶仔猪生产性能的提高和腹泻预防的效果显著优于中药制剂和复方益生菌制剂组。

2.2.2 对断奶仔猪血清中IgG含量的影响 由表2可知，随着生物控制剂饲喂时间的增加，各试验组IgG含量呈上升趋势；到42日龄时，试验3组IgG含量较试验1组、试验2组，分别提高了62.29%、17.44%（P＜0.05）。说明复方中药-益生菌生物控制剂能较好地提高仔猪血清中IgG的含量。

表1 复方中药-益生菌生物控制剂对断奶仔猪的影响 （Means±SD）

表2 复方中药-益生菌生物控制剂对断奶仔猪血清中Ig G含量的影响 （Mean±SD）

2.3 猪场环境中致病性大肠杆菌耐药性质粒消除与耐药性逆转的测定

2.3.1 猪场环境中致病性大肠杆菌耐药性质粒消除的测定 由表3可知，分离到的猪致病性E.coli菌株都含有质粒，但不同时间、不同试验组中菌株质粒数有较大差异。随着生物控制剂饲喂时间的增加，分离到菌株数量和菌株所含的平均质粒数都呈下降趋势，各试验组的质粒平均消除率分别为39.22%、6.25%、46.51%。说明复方中药-益生菌生物制剂对猪致病性大肠杆菌具有较好的质粒消除作用。

表3 猪场环境中大肠杆菌耐药性质粒消除的测定

2.3.2 猪场环境中致病性大肠杆菌耐药性逆转的测定 由表4可知，18日龄时各组分离到的致病性大肠杆菌对7种抗生素平均敏感率分别为7.09%、7.14%、6.96%、7.15%（P＞0.05）；经过不同生物制剂饲喂添加后，各试验组平均敏感率较对照组分别提高31.65%、22.40%和57.66%。

表4 猪场环境中大肠杆菌耐药性逆转的测定

2.4 猪粪中氨气释放量的测定 由表5可知，复方中药制剂、复方益生菌制剂、复方中药-益生菌生物控制剂的持续添加可以显著降低氨气的排放量，以复方中药-益生菌生物控制剂效果最佳，较对照组降低约50%。

表5 发酵猪粪中氨气释放量的测定

3 讨论

3.1 猪致病性大肠杆菌耐药性是猪大肠杆菌病防控的难点[12]。本试验在前期对87株猪致病性大肠杆菌具有质粒消除作用的中药筛选试验基础上，制备了以质粒消除为主导、兼有抗菌作用的石榴皮、黄芩、黄连复方中药质粒消除剂；为了达到预防治疗猪大肠杆菌病的目的，以前期试验筛选出的乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌为材料，制备复合益生菌制剂，二者协同使用，不仅提高了动物的生长性能和血清中IgG含量，而且对耐药性质粒具有消除作用，使菌株耐药性得以逆转，控制了耐药菌的产生。

3.2 控制和减少养猪生产中氨的释放量，是畜牧业可持续发展的需要。本试验制备的复方中药-益生菌生物控制剂，在结合中药和益生菌分别作为绿色饲料添加剂优势的基础上，利用中药能为益生菌的增殖扫除障碍，益生菌可以促进动物体对中药的消化吸收等协同作用效果，使饲料消化率得以大幅度提升，使猪粪中氨气释放量降低了约50%，对净化猪场环境起到了积极的作用。

3.3 试验表明，中药、益生菌的联合使用，具有较好的协同作用，但它们之间的关系不是简单的叠加，而是复杂的组合效应，其机理还有待进一步研究。同时，本试验中复方中药-益生菌生物控制剂使用是针对仔猪免疫生理特点、断奶应激而初步设立的。如何改进中药、益生菌复配比例、添加比例、饲喂时间等，使复方中药-益生菌生物控制剂在整个猪生产过程中发挥最大效益，将是我们下一步开展的研究工作。

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