辽宁省新城疫病毒F基因和H N基因的分子特征与致病性

赵晓彤，吴运谱，薛树山，石 霖，曹明慧，顾贵波，谷志大，魏 澍，何 欣，王宏燕，闫海滨，于长泳，曹 东

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳 110164；3.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081）

新城疫(ND)是由新城疫病毒（NDV）所引起的禽类一种急性、烈性传染病，其主要侵害鸡和火鸡，发病率和死亡率均非常高，为危害我国养禽业的最严重疾病之一[1]，世界动物卫生组织（OIE）规定为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，为国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）所规定的5种优先防治的一类动物疫病之一。

依据基因组长度不同，NDV分为Class I和Class II两大谱系[1]，Class I型的基因组长度为15198nt，Class II中I-IV型和V-IX型NDV分别为15186nt和15192nt。NDV虽只有一个血清型，但其毒株众多且毒力差别较大[1-3]，给ND的防制带来极大困难。NDV为单股不分节段负链RNA病毒，病毒基因组结构模式为3'-NPP-M-F-HN-L-5'，其囊膜表面糖蛋白-融合蛋白（F）介导病毒囊膜与靶细胞膜融合，促使病毒基因组进入胞桨[4]，为决定NDV毒力的主要因素之一。血凝素-神经氨酸酶（HN)能够识别靶细胞的唾液酸受体，介导病毒粒子对靶细胞的吸附，促使新生病毒粒子从感染细胞膜表面释放，并促进融合蛋白的融合功能[5]。因此对辽宁NDV分离株的F、HN基因进化规律的研究，可为本省制定新城疫防制对策提供依据。

1 材料与方法

1.1 SPF鸡胚 9-11日龄SPF鸡胚购自辽宁省益康生物股份有限公司。

1.2 主要试剂 NDV标准抗原及标准阳性血清、H5、H7、H9亚型禽流感标准阳性血清，购自哈尔滨维科公司；EDS76血凝抗原和HI试验阳性血清，购自中国兽医药品监察所；NDV核酸荧光RT-PCR试剂盒，购自深圳匹基公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂，购自宝生物工程（大连）有限公司。引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。TRIZol LS、DTT、RNaseOUT、鼠源反转录酶（MLV），购自Invitrogen公司。

1.3 引物设计 参照文献[7]设计合成F基因引物，上游引物为F1：5'-ATGGGCTCCAAACCTTC⁃TAC-3'；下游引物F2：5'-TTGTAGTGGCTCTCATC-3'，F基因预期片段大小为1700 bp。参照文献[8]设计合成HN基因引物，上游引物HN1:5'-GAT⁃CAGATGAGAGCCACTA CAA-3'；下游引物 HN2：5'-GATAGATGTGACTCTGGTAGGAT-3'。HN基因预期片段大小为2267 bp。新城疫通用反转录引物：5'-ACGGGTAG AA-3'。

1.4 病毒的检测鉴定 病料来源于本中心对辽宁省禽屠宰场的例行监测任务。研磨样品并提取核酸，应用NDV核酸荧光RT-PCR试剂盒检测。将4份阳性病料研磨液接种SPF鸡胚，收集尿囊液[8]，按照ND诊断技术标准进行HA和HI试验[9]，尿囊液均能被ND标准血清抑制，但不能被H5、H7、H9亚型AIV标准血清和EDS-76血清抑制，分别命名为 CK/CY1/2013、CK/DD2/2013、CK/YK1/2013、CK/TL4/2013，分别简称为CY1株、DD2株、YK1株和TL4株。

1.5 F基因和HN基因的扩增及序列测定 取各分离株的尿囊液200μL，按照Invitrogen公司TRIZol说明书操作，提取RNA。反转录反应体系：RNA悬液2μL，20 pmolRT反应引物2μL，混匀，70℃水浴5 min后立即冰浴3 min，依次加入dNTP（2.5 mmol/μL）4μL，0.1mol/L DTT 4μL，M-MLV 1μL（10 U），RNA酶抑制剂1μL（20 U），5×反转录酶缓冲液8μL混合均匀后。37℃水浴3 h。所获得cDNA用于F、HN基因片段扩增，PCR扩增体系：2.5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，0.5μL dNTPs，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U)，上、下游引物各0.5 μL，1.5μL cDNA，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件:95℃5 min；94℃2 min、53℃1 min、72℃2 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。阳性PCR产物送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.6 F基因、HN基因系统进化树及序列相似性分析 用Lasergene7.0的MegAlign对从GenBank下载32株NDV的F基因序列和19株NDV的HN基因序列进行序列分析。

1.7 致死鸡胚平均时间（MDT）测定 按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准(二〇〇一年版)[10]规定执行。

1.8 F基因的生物信息学分析 利用Lasergene 7.0软件和ExPASy服务器上的Prot Param软件（http://web.expasy.org/protparam/），分析NDV F基因的分子理化性质；利用TMHMM Server v.2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析F蛋白的序列跨膜区；利用SignalP 4.1软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测分析F蛋白的信号肽[11]。

2 结果

2.1 病毒检测及鉴定结果 所接SPF鸡胚均在72 h以内死亡，死亡鸡胚全身水肿、充血。收获尿囊液进行HA和HI试验。HA和HI试验结果表明，4个分离株的尿囊液均可凝集鸡红细胞，HA凝集效价均在27以上，不能被禽流感阳性血清所抑制，初步判定为NDV。ND病毒核酸荧光RT-PCR检测均为阳性，采用F、HN基因PCR引物均能扩增出相应条带。

2.2 F基因系统进化树及序列相似性分析结果 应用Lasergene 7.0软件的MegAlign软件Clust⁃al W方法构建NDV F基因的系统发生树，将NDV划分为9个基因型 (图1)。DD2株、YK1株和TL4株的F0蛋白裂解位点序列均为112GRQGRL117,具有弱毒株裂解位点特征[12]。CY1株的F0蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117，具有强毒株裂解位点特征[12]。

核苷酸同源性分析结果表明，4个分离株的F基因与基因Ⅰ型代表株Queensland V4、Ⅱ型代表株LaSota、Ⅲ型代表株Mukteswar及Ⅸ型标准强毒F48E9的F基因的同源性分别为96.6%～97.3%、95.9%～99.9%、95.8%～96.2%、96.6%～97.1%。CY1株与基因Ⅶ型代表毒株js02株F基因的核苷酸同源性最高，为98.9%；与疫苗株LaSota核苷酸同源性为95.9%；与疫苗株Queensland V4间的核苷酸同源性96.6%。DD2株、YK1株和TL4株与LaSota株核苷酸同源性均为99.9%，与Queensland V4株核苷酸同源性分别为96.6%、97.3%、97.3%。

图1 不同ND V毒株F基因进化树

2.3 HN基因系统进化树及序列相似性分析结果 以HN基因序列绘制的进化树显示，将NDV划分为9个基因型(图2)。4个分离株的HN基因之间，DD2株和TL4株间同源性最高，为97.5%；DD2株与CY1株间同源性最低，仅为89%。分离株CY1株与Ⅶ型js02株亲缘关系最近，HN基因同源性为 99.5%；CY1 株与 F48E9、Mukteswar、LaSota、Queensland V4间HN基因的核苷酸同源性分别为94.4%、90.6%、89.0%、83.7%。分离株DD2株、YK1株和TL4株与LaSota株HN基因之间同源性分别为99.9%、96.8%、97.5%；与Queensland V4株HN基因同源性均为92.2%、89.1%、95.1%；与Mukteswar株HN基因之间同源性分别为92.8%、89.7%、91.7%；与F48E9株HN基因之间同源性分别为91.9%、88.7%、94.4%。

图2 不同ND V毒株HN基因进化树

表1 4个ND V分离株的F蛋白生物信息学分析

2.4 致死鸡胚平均时间(MDT)测定结果 CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的MDT分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h。

2.5 4个NDV分离株的F基因生物信息学分析结果 采用Prot Param软件分析各分离株F基因的理化性质，结果如表1。应用TMHMM Server V2.0软件预测分析表明，各分离株F蛋白质序列均存在2个跨膜区。Signal P软件预测分析表明，各分离株F蛋白第1～31为氨基酸残基为信号肽，第32为氨基酸残基的综合剪切位点分值最高，据此推断各分离株F蛋白均含有信号肽，均为分泌性蛋白，最大可能剪切位点在第31～32位氨基酸之间。

3 讨论

F蛋白裂解位点是NDV毒力的主要决定因素，但因长期大剂量、高频次ND疫苗免疫所形成的高免疫压力及RNA病毒自身易变异特性，NDV易发生点突变，因此，NDV的分子流行病学研究首选对F基因进行分析，亦有大量研究对HN基因进行分析。在本研究中，采用HN基因序列进行基因型划分的结果(图2)，与采用F基因序列进行基因型划分的结果相同（图1），这也与相关研究结果相似[7]。通过裂解位点分析及与疫苗株LaSota、Queensland V4间亲缘关系分析，表明DD2株、YK1株和TL4株属于基因Ⅱ型，与LaSota株的亲缘关系最近，与Queensland V4株亲缘关系均较远，这可能与LaSota株疫苗普遍使用有关，但是否为疫苗突变株值得进一步研究。而CY1株属于Ⅶ型，与目前在养禽业中流行的Ⅶ型js02株的亲缘关系非常近，与LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。

根据毒力不同，NDV可分为强毒株、中强毒株及弱毒株3类；依据兽用生物制品规程规定，MDT小于60 h为强毒,在60～90 h为中强毒，大于90 h为弱毒；依据致病性分子基础的F蛋白裂解位点的不同进行分类，中强毒株、强毒株裂解位点氨基酸序列多为112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，弱毒株裂解位点氨基酸序列则多为112G/E-K/R-Q-G/E-RL117[12]。CY1株的F蛋白裂解位点及其MDT，表明其具有强毒株的特征，同时CY1株相关特性与从本省分离到的3个Ⅶ型毒株强毒株阜新株、沙河株、盘锦株的特性相似[13]，DD2株、YK1株和TL4株的MDT均在60～90 h，可归类于中等毒力范围内，裂解位点具有非强毒株的特征，因此还需要进行4个分离株的ICPI和IVPI试验以进一步研究。鉴于F蛋白可介导病毒囊膜与靶细胞膜的融合，促使病毒基因组进入胞浆，为感染性病毒粒子侵入宿主细胞的必需结构，因此本研究采用生物信息学技术对理化性质、跨膜区及信号肽进行初步分析，为进一步研究奠定基础。

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