非洲猪瘟病毒E183L、B 602L、K 205R和A 104R基因表达及诊断抗原筛选

张鑫宇，陈 宇，刘文俊，夏晓莉，孙怀昌

（扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009）

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种由ASFV引起家猪和野猪的传染病，具有死亡率高和传播迅速的特点[1]。1921年该病最早发现于东非的肯尼亚[2]，以后的几十年内传播到非洲、欧洲、美洲等许多国家，并且有继续蔓延的趋势[3-4]，目前虽然该病尚未传入我国，但近年来邻国大面积的流行[5]，使得我国面临严重威胁。

本研究选择了ASFV4种基因，其中ASFV E183L基因编码的p54蛋白，其抗体具有一定的病毒中和能力[6]；B602L基因编码的pB602L蛋白，可刺激机体产生较高水平的抗体[7]；K205R基因是一早期转录基因，其编码的pK205R蛋白能较早刺激机体产生抗体[7]；A104L基因编码的组氨酸样蛋白，能与ASFV抗体阳性血清发生免疫沉淀反应[8]。构建了携带这4种基因的重组载体，表达并纯化出重组蛋白pA104L、p54、pK205R和pB602L，分别以这4种重组蛋白包被酶标板，ELISA方法筛选可以用于ASFV抗体检测的诊断抗原，具体过程如下。

1 材料与方法

1.1 材料 重组质粒pGEX-4T-1-E183L、pGEX-4T-1-B602L、pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R 由 Gulbenkian de Ciência研 究 所 Parkhouse R M教授惠赠；原核表达载体pET-30a（+）、大肠杆菌BL21（DE3），购自Novagen公司；限制性内切酶、连接酶、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、dNTP；Ni-NTA琼脂糖，购自Qiagen公司；HRP标记羊抗猪IgG（H+L），购自Earthox公司；OPD，购自Sigma公司；ASFV抗体阴性、阳性血清由英国Pirbright研究所提供；其他化学试剂均为国产分析纯级试剂。

1.2 方法

1.2.1 表达载体构建 根据ASFV Ba71V株基因组序列（GenBank No.U18466.1）设计针对基因E183L和B602L特异性引物：p54F 5′-TAGAATTCCTATTCTCTTCAAGAAAG-3′，p54R 5′-TACTCGAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3′；pB602LF 5′-CTGAATTCATGGCAGAATTTAATATT⁃GATGAGCTTC-3′，pB602LR 5′-CTGCGGCCGCTTAC AATTCTGCTTTTGTATATAAAATT-3′，其中E183L上游引物从该基因第151核苷酸开始。以质粒pGEX-4T-1-E183L和pGEX-4T-1-B602L为模板，分别扩增一段402bp的E183L基因及B602L基因，扩增产物用限制酶EcoRⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、NotⅠ消化后，插入表达载体pET-30a（+），构建重组质粒pET-p54和pETB602L，并转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）。用限制内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切质粒pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R，将酶切下的小片段DNA插入载体pET-30a（+），构建重组质粒pET-K205R和pETA104R，转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）。

1.2.2 重组蛋白表达 将上述4种重组菌按1∶100接种2 mL卡那霉素（50μg/mL）2×YTK培养基，37℃培养至4 h，加入终浓度为1 mmol/L IPTG，37℃诱导表达4 h，离心沉淀菌体。0.01 moL/L pH值7.6 PBS洗涤2遍，400μL PBS悬浮菌体，加入400μL 2×上样缓冲液混匀，煮沸5 min，10000 r/min离心5 min后，取上清液进行SDS-PAGE（12%分离胶），电泳结束后，考马斯亮蓝G-250溶液染色3 h，用脱色液脱色，分析外源基因是否表达，同时设空载体转化菌对照。

1.2.3 表达产物纯化及鉴定 按照上述方法按比例进行重组菌扩大培养和诱导表达，离心沉淀菌体用PBS洗涤2遍，用超声波裂解仪裂解菌体，10000 r/min离心10 min，分别取部分离心上清及沉淀进行SDS-PAGE分析，确定表达产物是可溶的还是以包涵体形式存在。

按照Qiagen公司说明书，用His亲和层析凝胶纯化表达的重组蛋白，ND-1000紫外分光光度计（Nano Drop公司）定量蛋白浓度，并用0.01 mol/L pH值7.4 PBS调整最终浓度为1 mg/mL。Western blotting鉴定纯化的4种重组蛋白，所用的一抗为200倍56℃灭活2 h的ASFV抗体阳性猪血清，二抗为10000倍辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，最终用DAB显色。

1.2.4 间接ELISA 纯化的抗原包用0.05 mol/L pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，包被NUC公司96孔酶标板，100μL/孔，37℃作用2 h；PBST洗涤液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，0.05%Tween-20）洗板2次，200 μL/孔，3 min/次；加入封闭液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，5%脱脂乳粉），200μL/孔，37℃作用1 h；洗板2次后，加入用封闭液200倍稀释的血清，100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，加入1倍工作浓度的HRP标记羊抗猪IgG（H+L），100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，吸水纸上拍干板孔中液体，加入新鲜配制的OPD底物溶液，100μL/孔，室温静置15 min；加入2 mol/L H2SO终止反应，50μL/孔；酶标仪490 nm波长下，读取每孔吸光值。

2 结果

2.1 表达载体鉴定 将PCR产物及酶切产物插入载体pET-30a（+），限制内切酶酶切重组质粒pET-p54、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R进行鉴定，结果分别切下大小约402 bp、1809 bp、618 bp和315bp的DNA条带（图1），确认构建的重组载体正确。

图1 重组载体酶切鉴定

2.2 重组蛋白表达 IPTG分别诱导携带重组质粒pET-A104R、pET-B602L、pET-p54、pET-K205R的大肠杆菌表达，SDS-PAGE电泳裂解产物，结果上述4种重组菌分别表达预期大小的pA104R、pB602R、p54、pK205R重组蛋白，分子量分别为19 kDa、75 kDa、21 kDa和25 kDa，而诱导及空载体对照无相应的蛋白条带。

2.3 重组蛋白纯化及鉴定 IPTG诱导重组菌表达后，超声波裂解菌体，分别取离心上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示，除重组蛋白pK205R以包涵体形式存在外，其他3种重组蛋白pA104R、pB602R、p54均为可溶性蛋白。分别在尿素变性和非变性条件下进行Ni柱亲和纯化，纯化产物进行Western-blotting分析，结果显示，纯化的重组蛋白pA104R、pK205R、pB602R、p54与ASFV免疫血清均呈阳性反应（图2）。

图2 纯化的重组蛋白W estern-blotting分析

2.4 血清学诊断抗原筛选

2.4.1 重组蛋白检测高滴度的ASFV抗体 将重组蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R梯度稀释后包被酶标板，以ASFV弱毒OURT88/3接种后第20天感染强毒OURT88/1存活下来的猪血清为检测对象，间接ELISA测定其抗体，同时设立ASFV抗体阴性对照，结果重组抗原pK205R、p54和pB602L血清学反应较好，但pB602L与阴性血清有轻微的交叉反应（图3）。

2.4.2 重组蛋白检测不同时期的ASFV抗体 将重组蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R稀释成2μg/mL，包被酶标板，以ASFV弱毒OURT88/3接种后第6、13、19天采集的猪血清为检测对象，间接ELISA测定其抗体，同时设立ASFV抗体阴性对照，结果重组抗原p54在13 d时检测效果最好，pK205R次之（图4）。

图3 间接ELIS A检测高滴度A S FV抗体

图4 间接ELIS A检测A S FV感染后不同时期的抗体

3 讨论

非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种复杂的大DNA病毒，猪或野猪感染后，潜伏期通常为3～15 d，强毒株感染的死亡率可达到100%，毒力稍弱的毒株感染后表现为发热、精神沉郁等症状，低毒株感染出现亚临床症状或仅血清抗体转阳，易与猪其他疾病混淆[1]。OIE认为，在ASF流行疫区和低毒力ASFV感染初期地区进行调查、诊断，血清学方法是首推的诊断方法，而以纯化的重组蛋白作为检测抗原，比病毒感染后的可溶性细胞裂解更具优势[9]。

ASFV感染猪巨噬细胞后，细胞内至少可表达100种病毒蛋白，其中约50种能与感染或康复期猪血清发生抗原抗体反应[10]，2009年，Gallardo等[11]从ASFV感染康复猪血清中筛选到12种较强免疫原性 抗 原，以其中的 p54、pB602L、pK205R 和pA104L重组蛋白为抗原，分别建立了检测ASFV抗体的ELISA方法，田间检测发现，该ELISA方法与OIE推荐的ELISA方法具有较高的检测符合率。这些重组蛋白融合标签为谷胱甘肽S转移酶（GST），由于其分子量较大（26kDa），造成ELISA背景值较高，检测时需要设立GST本底对照。本研究对ASFV E183L、B602L、K205R和A104R基因进行了亚克隆，其中的E183L基因，由于前150个核苷酸编码疏水性蛋白和无B细胞表位蛋白，因此将其切除，并融合上组氨酸（His）标签，以表达纯化的重组蛋白为抗原进行ELISA试验，结果反应背景大大降低，检测时也不需要设立本底对照。

用不同抗原建立的间接ELISA分别检测ASFV感染后猪血清中的抗体，发现在感染后的中后期，pK205R、p54和pB602L检测效果较好，而在感染早期抗体检测时，p54检测效果最好，pK205R次之。由此可见，4种重组蛋白中，p54和pK205R无论在ASFV感染早期还是中后期，均可用作诊断抗原检测相应的抗体，这对今后检测ASFV抗体试剂盒的开发具有重要的指导意义。

[1]Straw B E，Zimmerman J J，Allaire S D，et al.Disease of Swine[M].9th ed.Wiley-Blackwell Publishing，2006:291-298.

[2]Montgomery R E.On a form of swine fever occurring in British East Africa(Kenya Colony)[J].Journalof Comparative Pathology，1921，34:59-191.

[3]Nix R J，Gallardo C，Hutchings G，et al.Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis offour variable ge⁃nome regions[J].Archives ofVirology，2006，151:2475-2494.

[4]Sanchez-Vizcaino J M，Mur L，Martine-Lopez B.African swine fe⁃ver:an epidemiologic update[J].Transboundary and Emerging Disease，2012，59:1-9.

[5]http://web.oie.int/wahis/public.php.

[6]Gomez-Puertas P，Rodriguez F，Oviedo J M，et al.The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two dis⁃tinctsteps ofvirus attachmentand both contribute to the antibodymediated protective immune response[J].Virology，1998，243:461-471.

[7]Gutierrez-Castaneda B，Reis A L，Corteyn A，et al.Expression,cellular localization and antibody responses of the African swine fever virus genes B602L and K205R[J].Archives of Virology，2008，153:2303-2306.

[8]Borca M V，Irusta P M，Kutish G F，et al.A structural DNA bind⁃ing protein of African swine fever virus with similarity to bacterial histone-like proteins[J].Archives of Virology，1996，141:301-313.

[9]OIE.African swine fever.In:Manual of Diagnostic Tests and Vac⁃cines for Terrestrial Animals[M].Office International des Epizo⁃oties Paris France(Chapter 2.8.1，NB:version adopted in May 2012).

[10]Gallardo C，Blanco E，Rodriguez M J，et al.Antigenic properties and diognostic potential of Afican swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells[J].Journal of Clinical Microbiology，2006，44(3):1489-1495.

[11]Gallardo C，Reis A L，Kalema-Zikusoka G，et al.Recombinant Antigen Targets for Serodiagnosis of African Swine Fever[J].Clini⁃caland Vaccine Immunology，2009，1012-1020.