GC/MS法同时分析液体制剂及口服液型保健品中31种防腐剂和抗氧化剂

陈安东，吴兆伟，余 倩，王铁松，车宝泉，丛骆骆

(1.北京市药品检验所，北京 100035； 2. 北京市食品药品监督管理局，北京 100053)

防腐剂和抗氧化剂是药品、保健食品中常见的添加剂，具有防腐、抑菌杀菌、延长保质期的作用，常用的防腐剂与抗氧化剂有苯甲醇、山梨酸、乙氧基喹啉、尼铂金类、异噻唑啉酮类、苯扎氯铵类等[1-7]。目前，关于防腐剂与抗氧化剂的研究已有文献报道，但主要集中在食品、化妆品和一些工业领域中[8-17]。在药品中同类物质的研究报道较少，且被测组份经常为单一领域内使用的防腐剂及抗氧化剂，一次性检测的种类一般不超过20种。而目前在医药行业，一些企业利用监管部门还未制定防腐剂及抗氧化剂使用规定的现状，在利益的驱使下，使用了廉价的或不允许添加的、跨行业的防腐剂，给人们的用药安全带来了危害。针对这种情况，有必要开发一种可用于检测药品、保健品中的防腐剂及抗氧化剂的方法，为药品监管提供有力的技术支持。

本研究采用气相色谱-质谱(GC/MS)联用技术，建立一次检测31种防腐剂及抗氧化剂的方法。为配合药品监管，该方法的被测物质涵盖了药品、食品、保健品和化妆品等多个行业中常见的防腐剂和抗氧化剂。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TRACE 1310 ISQ气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo-Fisher公司产品；Agilent 7890A-5930气质联用仪：美国Agilent公司产品；超声仪SB-25-12-DT：宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

无水乙醇(色谱级)：德国Merck公司产品；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的对照品：由中国食品药品检定研究院提供；丙酸、苯甲醇、山梨酸、苯甲酸、桂皮醛、对羟基苯甲酸异丁酯：美国AccuStandard公司产品；三氯叔丁醇、苯酚、邻甲酚、对甲酚、间甲酚、2-甲基异噻唑啉酮、2-甲基氯异噻唑啉酮、苯氧乙醇、麝香草酚、对氯邻甲酚、对氯间二甲酚、叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)：德国Dr. Ehrenstrofer 公司产品；脱氢乙酸、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、对羟基苯甲酸正庚酯：北京百灵威科技有限公司产品；对羟基苯甲酸异丙酯、乙氧基喹啉、己基间苯二酚：东京化成工业株式会社产品；桉叶素：美国 ChromaDex公司产品；苯乙醇：美国Chem Service公司产品。

1.2 标准溶液的配制

称取0.01 g各种防腐剂及抗氧化剂对照品，以无水乙醇为溶剂，稀释成各组份浓度为0.05 g/L溶液，作为标准品储备液A；精确量取1 mL标准品储备液A，置于100 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，作为标准品储备液B；标准品储备液A和B均放置于4 ℃冰箱中，冷藏保存。

分别精确量取2.0、1.0、0.5 mL标准品储备液A和10.0、5.0、1.0、0.5 mL标准品储备液B，置于已精确加入0.4 mL空白基质样品(即经检测各组份均低于检出限的中药口服液样品，基质为水溶液)的50 mL容量瓶中，加适量无水乙醇，超声10 min，冷却后加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，作为标准工作溶液1～7，其中防腐剂的含量分别为2.0、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mg/L。

1.3 样品前处理

精确量取2.0 mL摇匀后样品于250 mL量瓶中，加适量无水乙醇，超声10 min，冷却后加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：DB-624UI(60 m×0.25 mm×1.4 μm)；进样口温度：250 ℃；升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持25 min；初始流速1 mL/min，保持20 min，以2 mL/min升至2 mL/min，保持20 min；载气：He；进样量：1 μL；分流进样，分流比5∶1。

1.4.2质谱条件 传输线温度：250 ℃；离子源温度：280 ℃；离子化方式：EI；电子能量：70 eV；延迟时间：6.0 min；检测方式：选择离子监测(SIM)。

2 结果与讨论

2.1 标准物质以及典型样品的总离子流图

在1.4条件下，分别采用Thermo TRACE 1310 ISQ气质联用仪和Agilent 7890A-5930气质联用仪对标准工作溶液1进样，获得的SIM离子流图示于图1、图2。经比较，31种防腐剂和抗氧化剂在两台不同厂家的仪器中保留时间基本一致，分离效果良好。31种防腐剂和抗氧化剂的保留时间及特征离子峰列于表1，滴眼液1样品的离子流图示于图3。

2.2 基质干扰

实验中绘制了2条标准曲线：一条为1.2中标准工作曲线(即已添加了水溶液基质的标准工作曲线)；另一条与第1条曲线中各待测物质浓度一致，但未加空白基质样品。现取其中一点(浓度为0.1 mg/L)对其峰面积进行对比(由于组份太多，仅选其中的9种)，结果示于图4。由图4可见，大部分组份的基质效应明显，相同浓度组份的峰面积差别较大，因此在进行定量分析时，应采用基质加标法做标准曲线，所用的基质应与待测样品同剂型。

图1 使用TRACE 1310 ISQ测定31种防腐剂及抗氧化剂的SIM色谱图Fig.1 Chromatogram of 31 preservatives and antioxidants by TRACE 1310 ISQ

图2 使用Agilent 7890A-5930测定31种防腐剂及抗氧化剂的SIM色谱图Fig.2 Chromatogram of 31 preservatives and antioxidants by Agilent 7890A-5930

图3 使用TRACE 1310 ISQ测定滴眼液1样品的SIM色谱图Fig.3 Chromatogram of eye drops 1 sample by TRACE 1310 ISQ

序号名称保留时间/min 定量离子m/z定性离子m/z1丙酸 Propionic acid6.7674.057.0, 73.02三氯叔丁醇 Acetonchloroform hemihydrate10.7559.077.0, 125.031,4-桉叶素 1,4-Cineole11.0281.0108.0, 154.04苯酚 Phenol11.0494.066.0, 65.05苯甲醇 Benzyl alcohol11.63108.079.0, 107.06山梨酸 Sorbic acid11.88112.097.0, 67.07邻甲酚 o-Cresol12.02108.0107.0, 79.08间甲酚 p-Cresol12.41108.0107.0, 79.09对甲酚 m-Cresol12.41108.0107.0, 79.010苯乙醇 Phenethyl alcohol12.8791.0122.0, 92.011苯甲酸 Benzoic acid13.77105.0122.0, 77.012甲基异噻唑啉酮 Methylisothiazolinone14.37115.087.0, 58.013苯氧乙醇 2-Phenoxyethanol14.5694.077.0, 138.014甲基氯异噻唑啉酮 Methylisothiazolinone14.82149.057.0, 85.015麝香草酚 Thymol15.35135.0150.0, 91.016桂皮醛 Cinnamaldehyde15.49131.0132.0, 103.017对氯邻甲酚 4-Chloro-2-methylphenol15.84107.0142.0, 77.018脱氢乙酸 Dehydroacetic acid17.13168.0153.0, 85.019对氯间二甲酚 4-Chloro-3,5-dimethylphenol17.69121.0156.0, 91.0202,6-二叔丁基对甲酚 BHT18.47205.0220.0, 145.021叔丁基羟基茴香醚 BHA18.79165.0137.0, 180.022对羟基苯甲酸甲酯 Methylparaben19.48121.0152.0, 93.023对羟基苯甲酸乙酯 Ethylparaben20.79121.0166.0, 138.024叔丁基对苯二酚 TBHQ21.12151.0166.0, 123.025对羟基苯甲酸异丙酯 Isopropylparaben21.20121.0138.0, 180.026对羟基苯甲酸丙酯 Propylparaben22.50121.0138.0, 180.027乙氧基喹啉 Ethoxyquin23.43202.0174.0, 145.028对羟基苯甲酸异丁酯 Isobutyl 4-hydroxybenzoate23.68121.0138.0, 65.029对羟基苯甲酸丁酯 Butylparaben24.72121.0138.0, 194.030己基间苯二酚 4-Hexyl-1,3-benzenediol27.18123.0194.0, 124.031对羟基苯甲酸庚酯 Heptyl 4-hydroxybenzoate36.52138.0121.0, 65.0

图4 实验中的基质效应Fig.4 Matrix effects on GC/MS analysis

2.3 标准曲线、线性范围及检出限、定量限

按1.2方法测定样品的系列标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，标准工作溶液浓度为横坐标，得到样品的标准曲线方程列于表2。另外，精确量取0.4 mL空白基质样品于50 mL容量瓶中，添加不同体积的标准品储备液B，制成比标准工作溶液7浓度更低的混合标准溶液，以信噪比S/N=3时的添加浓度作为本方法的检出限，信噪比S/N=10时的添加浓度作为定量限，31种防腐剂的检出限为0.001～0.008 mg/L，定量限为0.003～0.020 mg/L，结果列于表2。

2.4 回收率及精密度

精确量取0.4 mL空白基质样品于50 mL容量瓶中，分别添加0.020、0.060、0.300 mg/L混合标准溶液，按1.3方法进行样品前处理和测定，每个水平做3次平行实验，计算各防腐剂组份的平均回收率及相对标准偏差(RSDs)，结果列于表3。

另外，精确量取6份0.4 mL空白基质样品，置于50 mL容量瓶中，分别加入一定体积的混合标准溶液，使样品中防腐剂含量为0.10 mg/L，按1.3方法进行样品前处理和测定，计算每个组份的相对标准偏差，作为日内精密度，结果列于表3。

实验结果表明，31种物质的日内精密度均小于5.0%，且大部分小于2.0%，能满足检测要求。

2.5 实际样品检测

使用本方法对市场上常见的共70批液体药物制剂及口服液保健品样品进行检测，具体品种及检测结果列于表4、表5。经检测发现：50%以上的样品中含有防腐剂，并且其中不少样品的标签与说明书中均未注明含有防腐剂；在部分药品中检出了不允许添加的防腐剂，例如，在6批注射液中检出微量苯酚。

2.6 实际样品检测结果分析

应用本方法在32批非外用药品中检出微量苯酚，其中6批为注射液。苯酚是制药业中常见的有机原料，使用范围广，有很强的中枢神经毒性，成人致死量约为1 g[18]。20世纪，苯酚可用作外用制剂与注射液中的防腐剂，但由于毒性较大，近年来仅限用于外用制剂，不得用于口服液或注射液，而实际检验结果反映出仍有一些厂家违规使用苯酚。

检测的70批样品大部分为水溶液基质，定性和定量结果均良好。除水溶液基质外，同时对糖浆剂、酊剂2种不同基质进行了检出限考察，二者的检出限浓度与水溶液基质的结果基本一致。由于样品量不足，本实验仅对2批糖浆、2批酊剂进行了测定，在其中1批酊剂中检测出山梨酸，说明本方法可以对酊剂及糖浆剂进行定性检测。

表2 31种防腐剂及抗氧化剂的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

表3 31种防腐剂和抗氧化剂的回收率和日内精密度

表4 样品检测结果

表5 检出防腐剂及抗氧化剂的含量

3 结论

本实验建立了气相色谱-质谱联用法测定以水、醇等液体为基质的药品及保健品中的防腐剂及抗氧化剂，方法的线性关系良好，大部分组份的回收率在90%～110%之间，日内精密度均小于5%，方法检出限能满足使用要求。应用该方法检测了市场上常见的共70批液体药物制剂及口服液保健品实际样品，其中有46批检出了防腐剂，并且该样品标签中均未标注，说明目前国内药品、保健食品中存在比较严重的防腐剂滥用现象，尤其是注射剂中含有防腐剂，存在较大的安全隐患，需要进行严格监管。

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