中药地黄中抗化学性肝损伤的活性成分研究

付锦楠，张文萌，孙立新，郭建军，何顺华，王晓玲

(1.江西省科学院微生物研究所，330096，南昌;2.临沂市食品药品检验检测中心，276000，山东，临沂;3.沈阳药科大学药学院，110016，沈阳;4.上海中医药大学基础医学院，201203，上海)

0 引言

地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块根[1]，始载于《神农本草经》，被列为上品。地黄在药材上分为鲜地黄、生地黄。鲜地黄性寒，味甘苦，能清热生津，凉血止血。生地黄性寒，味甘，能清热凉血，养阴生津。地黄是临床常用的中药材，近年来国内外对地黄的化学成分和药理作用进行了大量深入的研究，证实地黄除了对血液系统、免疫系统、内分泌系统、心血管系统以及神经系统有作用外，还具有抵制胃酸分泌、改善肾功能以及保肝作用等[2]。然而由于地黄中化学成分复杂多样，这些药理活性的物质基础是什么，到目前为止并不清楚。

现代药理研究表明[3]，中药发挥作用的一个重要步骤是活性成分与靶细胞膜、细胞内特异性酶或受体结合。大多数药物需要通过细胞膜产生药理活性，其活性与细胞膜亲和性和通透性密切相关，因而采用细胞作为筛选工具来探寻中药物质基础研究成为可能。由于不同种类细胞膜上具有不同种类受体、离子通道、酶等效应靶点，因而可以针对不同药理效应指标选择特定的体外细胞作为筛选工具。这使得基于细胞的细胞膜色谱技术，成为探索中药药效物质基础的重要手段之一[3～5]。细胞膜色谱技术分为细胞膜生物亲和色谱技术与细胞膜固相色谱技术[4]。细胞膜固相色谱法是直接以活性细胞为分离载体，以中药提取物为研究对象，依据提取物中的成分与细胞是否具有特异亲和能力而进行分离，采用色谱比较中药提取物与细胞结合前后中药提取物色谱图的变化，分析细胞破碎液中与活性细胞相结合的成分，应用HPLC或LC-MS等色谱技术进行鉴定，从复杂的中药体系中筛选出与活性细胞相互作用的成分。该方法与细胞膜生物亲合色谱技术相比，能保持细胞膜的完整性，操作简便易行，已用于多种单味中药以及复方中活性成分的筛选[5]。应用肝细胞建立的细胞膜色谱也已从栀子[6]以及当归补血汤[7]中鉴别了多个活性成分。

现已证实地黄具有保肝作用[2]，但其保肝的活性成分未见有研究报道。笔者前期对地黄的化学成分及质量控制方法进行了研究[8，9]，在此基础上应用原代肝细胞建立肝细胞膜色谱法，首次从地黄中鉴别出了能与肝细胞作用的2个活性成分:麦角甾苷和吉奥诺苷B1，并进一步证实其对H2O2诱导肝细胞损伤具有一定的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

生地黄药材购于上海，由上海中医药大学崔亚军副教授鉴定为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.)的干燥块根;正常人肝脏组织细胞HL-7702购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。对照品:麦角甾苷购于成都曼思特生物科技有限公司(HPLC纯度大于98%);异麦角甾苷和松果菊苷购于上海顺勃生物科技有限公司(HPLC纯度大于98%);吉奥诺苷B1和马替诺苷为自制(HPLC纯度大于99%)。Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)，日本同仁化学研究所;胎牛血清，天津TBD公司;RPMI-1640培养基干粉以及胰蛋白酶，美国Gibco公司;二甲基亚砜(DMSO)、过氧化氢等购自国药集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 地黄提取液指纹图谱的HPLC测定

1)供试液的制备。取生地黄药材用50%甲醇加热回流提取3次，每次1 h，纱布过滤，浓缩至每毫升含1.0 g生药。放冷，离心，上清液经0.45 μm滤膜滤过，供HPLC分析。

2)对照溶液制备。采用麦角甾苷(acteoside)、异麦角甾苷(isoacteoside)、松果菊苷(echinacoside)、吉奥诺苷B1(Jionoside B1)和马替诺苷(martynoside)为参照物，精密称定适量，用50%甲醇水溶液溶解，配制成混合对照品溶液，供HPLC分析。

3)地黄提取液指纹图谱的建立。色谱条件:色谱柱，Dikma Platisil ODS C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相，A(水溶液)-B(乙腈);梯度洗脱程序，0－10 min(0%B)，10－15 min(0% ～1%B)，15－45 min(1% ～9%B)，45－80 min(9% ～25%B)，80 －90 min(25% ～90%B)，90－100 min(90%B);流速:1 mL/min;检测波长，330 nm;柱温，30 ℃;进样量，20 μL。

1.2.2 肝细胞膜色谱鉴别地黄提取液中的活性成分

1)HL-7702肝细胞的获取及培养。HL-7702细胞来源于人正常肝组织，具有贴壁生长、接触抑制、密度依赖性、生长速度稳定等生物学特性。镜下观察细胞形态为多边形，相互连接成岛状。肝细胞在含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱培养。

2)地黄效应成分与肝细胞的结合。取地黄提取液0.1 mL，以 RPMI1640液稀释至5 mL，配制成含生药20.0 mg/mL的地黄培养液，加入到肝细胞中;置37℃，5%CO2，培养箱中培养1 h。

3)未结合成分的洗脱。将培养后的细胞加入10 mL PBS缓冲液并用吸管轻轻吹打，洗涤，离心(1 000 r/min，10 min)，取上清液，如上操作直至HPLC检测洗涤液无保留峰。

4)肝细胞结合地黄成分的解离。将洗涤后的肝细胞中加入pH4的D-Hanks缓冲液2 mL，置培养箱中培养1 h，使细胞上的靶点失活，将结合的药物释放出来。离心(1000 r/min，10 min)，得上清解离液。

5)上清解离液的色谱分析。将所得最后一次洗涤液及上清解离液经0.45 μm滤膜过滤，冻干，残渣用200 μL 50%甲醇-水复溶，涡旋均匀，离心(12 000 r/min，10 min)。吸取上清液 20 μL进样。

1.2.3 麦角甾苷和吉奥诺苷B1对H2O2诱导的细胞损伤的保护作用 采用HL-7702肝细胞，实验时以5×104cells/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养24 h后加药。同时设阴性对照组(只接种细胞作为正常对照)、空白组(不接种细胞只加等量的培养液以消除背景)、模型组、用药组(保护组和毒性组)。每组均设5复孔，用药组(保护组和毒性组)每孔加药75 μL，其他组平行加入培养液相同体积。培养22 h后，保护组和模型组每孔加入25 μL H2O2(终浓度为0.8 mM)继续培养1 h后，所有组同时加入10 μL CCK-8试剂，37℃温育1 h，用酶标仪在450 nm波长下测OD值，计算细胞存活情况。

细胞存活率(%)=(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100%

统计学分析:数据以均数表示，每组设5复孔，组间比较采用 T检验(T-TEST)，P≤0.05为有组间数据差异，有统计学意义。

2 结果分析

2.1 地黄提取液HPLC指纹图谱

平行制备3份地黄供试品，选择样品共有的、保留时间及峰面积相对稳定的22个色谱峰作为地黄指纹图谱的共有峰，地黄的HPLC指纹图谱和混合对照品图谱见图1，将混合对照品峰作为参照物峰，记录各共有峰的相对保留时间。

图1 地黄提取液指纹图谱

图2 5种混合对照品图谱

2.2 肝细胞膜色谱鉴别地黄提取液中的活性成分

最后一次洗涤液(A)、D-Hanks空白对照液(B)、空白对照解离液(C)、地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)与地黄提取液指纹图谱(E)的HPLC对照图。由图3可见，地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)可检测到6个色谱峰，与最后一次洗涤液(A)和空白对照液(B)对比，其中峰a在D-Hanks空白液(B)里面出现，故为D-Hanks里物质，峰c和峰f在空白对照解离液(C)里均出现，故不是地黄提取液与肝细胞结合的成分;与空白对照解离液(C)对比，仅峰b、峰d和峰e在地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)中存在。与地黄提取液指纹图谱(E)对照，表明峰b、峰d和峰e这3个峰是地黄提取液中与肝细胞结合的成分，分别对应于地黄提取液指纹图谱(E)中的峰10、11和12，其中峰11为麦角甾苷，峰12为吉奥诺皂苷B1，因而地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)中的峰d为麦角甾苷，峰e为吉奥诺皂苷B1。而地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)中峰b(相当于地黄提取液指纹图谱中的峰10)还有待进一步鉴定。

图3 最后一次洗涤液(A)，D-Hanks空白对照液(B)，空白对照解离液(C)，地黄提取液作用于肝细胞后的解离液(D)，地黄提取液指纹图谱(E)的HPLC对照图

2.3 地黄中活性成分对H2O2诱导肝细胞损伤的保护作用

H2O2是一种强氧化剂，是经典的诱导细胞发生氧化损伤的试剂，在多种组织损伤中发挥了关键性作用。H2O2作用肝细胞后，它能被细胞色素P-450代谢分解，生成·OH自由基，进而攻击细胞生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，大量消耗细胞内源性还原物质GSH，增加过氧化产物MDA的积累，最终导致细胞死亡[10]。CCK-8是一种用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法[11]。本文采用CCK-8比色法进行细胞毒性检测，探讨地黄中与肝细胞结合的化学成分麦角甾苷和吉奥诺苷B1对H2O2诱导肝细胞损伤的保护作用。结果显示，麦角甾苷(acteoside)对H2O2诱导下的人正常HL-7702肝细胞损伤都有一定的保护作用且无毒性，这与文献报道[12]结果基本一致;吉奥诺皂苷B1(jionoside B1)在低浓度下对肝损伤有一定的保护作用，高浓度下对肝损伤保护作用逐渐减弱且出现一定细胞毒性，吉奥诺皂苷B1为首次报道其在低浓度下对H2O2诱导下的人正常HL-7702肝细胞损伤的有一定的保护作用，实验结果见表1、表2。

表1 麦角甾苷和吉奥诺苷B1对H2O2诱导的肝损伤有保护作用(χ±s，n=5)

3 讨论

地黄是临床常用的中药材，近年来国内外对地黄的化学成分和药理作用进行了大量深入的研究。然而由于地黄中化学成分复杂多样，其药理活性的物质基础并不清楚。中药药效物质基础的研究是近年来中药研究的热点领域之一，本文以HL-7702肝细胞构建肝细胞膜色谱，并运用到地黄抗化学性肝损伤的活性成分研究。首次发现地黄中的麦角甾苷和吉奥诺苷B1能与肝细胞结合，进一步证实这2个化合物对H2O2诱导肝细胞损伤具有一定的保护作用，是地黄中抗化学性肝损伤的活性成分。

表2 麦角甾苷和吉奥诺苷B1对HL-7702的细胞毒性(χ±s，n=5)

在肝细胞膜色谱研究中还有一些色谱峰未能鉴定，有待进一步的实验证实;地黄中能与肝细胞结合的效应成分如麦角甾苷和吉奥诺苷B1，它们结合于肝细胞的什么靶点，对肝细胞损伤保护作用的作用机制如何，也还有待进一步研究。另外，和所有的离体实验一样，肝细胞膜色谱法也有其局限性，对于在体内发生代谢转化后发生作用的、不直接作用于肝细胞的一些效应成分无法追踪。

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