基于ITS序列分析对杏鲍菇菌种的鉴定

李 莹，李 莉，刘艳玲，李剑梅，王艳华

(1.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳 100861;2.辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳 122000)

杏鲍菇(Pleurotus eryngii(DC.et Fr.)Quèl.)又名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门(Basidio-mycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae)，伞菌目(Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)［1］。杏鲍菇是一种高蛋白、低脂肪的保健品，营养丰富，菌肉肥厚、质地脆嫩、有杏仁香味、口感极佳，由于其子实体色泽雪白，也称“雪茸”，有“平菇王”和“草原上的美味牛肝菌”之称［2］。据研究，杏鲍菇子实体含有蛋白质、粗纤维、多糖、粗脂肪、氨基酸、维生素、矿物元素等，不仅具有食用价值［3］，还具有一定的药用价值，可促进人体对脂类物质的消化吸收和胆固醇的溶解［4］，对肿瘤有一定的预防和抑制作用［5］，还含有利尿、健脾胃、助消化的酶类，具有强身、滋补、增强免疫力的功能［6］。拮抗反应是某些真菌识别异己保持群体遗传多样性的反应，它是由基因组内异核体不亲和(heterokaryon incompatibility，het)位点控制的。当不亲和的菌株共同培养时，由于het位点的识别作用，菌株间就会产生拮抗反应，在交界处形成隆起、沟或隔离，从而防止遗传上明显不同的个体间菌丝的融合，以保持个体遗传上的独立和稳定。拮抗反应不仅表现在种间，也表现在种内品种间，根据拮抗线的宽度、颜色等特征，可以鉴别种(或品种)的差异。真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域，包括内转录间隔区1(ITS1)、5.8SrDNA、内转录间隔区2(ITS2)［7］。在大多数生物中，18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列趋于保守，种间变化较小，作为非编码区的ITS1区和ITS2区，在进化过程中承受较小的自然选择压力，所以相对变化较大，可提供系统学分析所需的详尽的可遗传性状［8］。ITS序列在绝大多数真核生物中都表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能表现出差异，显示最近的进化特征［9］。由于ITS序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，且ITS序列片段较小、易于分析，已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中［10］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本实验共收集了20株供试菌株(表1)，其中12株是保藏菌株(编号1～12)、8株是工厂化栽培菌株(编号13～20)。

表1 供试菌株Table1 The tested strains

1.1.2 PDA综合培养基 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB11 片，水1 L。

1.1.3 主要仪器和试剂 电泳仪(DDY-III，北京六一仪器厂)，手动型生物安全柜(SPX-safe-1200，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，PCR仪(Applied Biosystems GeneAmpPCR System 2700)，CTAB(天津博迪化工有限公司)，Tris碱(国药集团化学试剂有限公司)，TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖(北京康为世纪公司生物科技有限公司)，PCR引物(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 拮抗实验 20株供试菌纯化后，用打孔器取直径0.5 cm的7 d菌龄的菌，在同一平板上按品字形接种，于25℃恒温箱培养10 d，每个处理重复3次，观察菌丝接触区的拮抗现象。

1.2.2 DNA提取 供试菌基因组DNA的提取采用CTAB法［11］。将纯化的供试菌接于PDA平板中，25℃培养，待菌丝长满，刮下约0.2 g，放入1.5 mL的离心管中，加入0.2 g灭菌的石英砂，研磨5～10 min，再加入500 μL 65℃预热的2×CTAB，65℃水浴60 min，每隔5～10 min颠倒1次;加500 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min，重复1次;取上清加入2/3体积的－20℃异丙醇，1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)，混匀，－20℃放置90 min至过夜;4℃、12 000 r/min离心10 min，出现沉淀，弃液相，加入－20℃的75%乙醇500 μL，上下颠倒洗涤，重复1次;弃乙醇，晾干，加入100 μL TE溶解DNA，－20℃保存备用。

1.2.3 ITS-PCR 扩增以 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为引物［12］。50 μL反应体系:10×TaqPCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，F Primer2 μL，R Primer 2 μL，TaqDNA 聚合酶1 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 33 μL;PCR扩增程序:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸2 min。

1.2.4 测序与分析 PCR扩增产物送华大基因(北京)经纯化后进行单向测序。测得的ITS序列通过BLAST软件进行同源序列比较，选择了与供试菌ITS序列相似度99%以上的8条序列，以香菇的ITS序列为外类群构建系统发育树［13-15］。采用Clustal X软件对DNA序列进行排序，运用MEGA 4.0分析软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树，进行1 000次Bootstrap可信度分析，Kimura 2-parameter法计算遗传距离，空位作为完全缺失(Complete deletion)处理，设置相同的转换(Transition，Ti)和颠换(Transversion，Tv)权重。

2 结果与分析

2.1 拮抗实验

拮抗反应是鉴定菌株间遗传差异的传统方法，菌丝间的拮抗反应是菌株间不同遗传特性的一个重要表现［16］。亲缘关系越远，菌株间的拮抗作用越明显，遗传差异越大，反之亦然［17］。本实验根据NY/T 1845-2010食用菌菌种区别性鉴定(拮抗反应法)判定标准，在灯光或自然光下观察，同一平板中不同菌株的菌丝能融合在一起，接触区的菌丝未呈现隆起、沟、隔离，并同其他区域内菌丝没有明显差异的认为没有拮抗反应(图1A)，但不能确定为相同品种。若出现隆起、沟、隔离三者之一的认为有拮抗反应，实验中菌株相接触的区域形成一条菌丝稀疏(图1B、图1C)或没有气生菌丝接触(图1D)的拮抗线，可认为是不同的品种。根据拮抗现象的有无，初步将20株菌聚成5个类群(表2)，第Ⅰ类群:杏1(辽宁)、杏M;第Ⅱ类群:杏25、杏511、杏5X-42;第Ⅲ类群:杏3寿、杏丰12、杏B、杏C、农大杏(北)、杏1(内蒙古)、杏2、杏3、X杏、DM2、杏6、L杏、杏9;第Ⅳ类群:杏丰68;第Ⅴ类群:杏528寿。对于前3个类群，每个类群内的菌株间无拮抗反应，却与其他菌株均有拮抗反应，说明类群内菌株彼此间的亲缘关系很近，可能起源于同一个菌株，或为同种异名;后2个类群分别与所有供试菌株都发生拮抗反应，表明这2个菌株与其他菌株间的亲缘关系较远。

图1 部分菌种拮抗实验图片Fig．1 Part of antagonism experiment

图2 部分菌株出菇情况Fig．2 Some strains fruiting condition

在相同的培养条件下，第Ⅰ类群的杏1(辽宁)、杏M菌丝气生性较强，菌落洁白浓密，呈絮状，边缘整齐，给予一定的温差刺激后，杏1(辽宁)未现菇蕾，杏M现原基;第Ⅱ类群菌丝气生性强，菌落洁白浓密，呈絮状，边缘整齐，给予一定的温差刺激后，杏丰12、杏3、X杏、杏3寿、杏9现原基，杏B、杏C、农大杏(北)、杏1(内蒙古)、杏2、DM2、杏6、L杏出现较多菇蕾;第Ⅲ类群的杏25、杏511、杏5X-42菌丝气生性不强，菌落较洁白浓密，呈毯状，边缘整齐，给予一定的温差刺激后未现菇蕾;第Ⅳ类群的杏丰68菌丝气生性强，菌落洁白浓密，呈絮状，边缘整齐，给予一定的温差刺激后菌丝扭结;第Ⅴ类群的杏528寿，菌丝气生性不强，菌落较洁白浓密，呈毯状，边缘整齐，给予一定的温差刺激后现菇蕾(图2)。

表2 20株菌株间的拮抗反应结果Table2 Antagonism results of 20 tested strains

2.2 ITS 序列分析

2.2.1 PCR扩增 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带清晰(图3)，大小在600～800 bp之间。

图3 20株菌的ITS序列电泳图谱Fig.3 The sequence of ITS electrophoresis of 20 strains

2.2.2 ITS序列 经对位排列，获得20株供试菌的ITS序列长度为624 bp，与GenBank数据库中的杏鲍菇菌种的ITS序列相似度为99%以上，在种的水平上证明供试菌株为杏鲍菇。在ITS序列中共有583个保守位点(Conserves sites)，41个变异位点(Variable sites)，30个简约信息位点(Parsimony-informative sites)，11个单个碱基变化位点(Singleton sites)，无插入/缺失。20株供试菌的ITS序列各碱基含量:A为24.5%～25.3%，平均值为25.0%;T为30.3%～31.3%，平均值为30.5%;G为21.6%～22.3%，平均值为22.0%;C为22.0%～22.8%，平均值为22.5%;G+C为43.6%～45.1%，平均值为44.5%。G+C含量能反映属种间的亲缘关系，含量差异越小，亲缘关系越近。本实验供试菌的G+C含量差异不明显，说明亲缘关系较近［18］。

2.2.3 聚类分析 采用N-J法构建系统发育树进行聚类分析(图4)，结果表明20株杏鲍菇菌株聚成4个类群:第Ⅰ类群:杏M、杏1(辽宁);第Ⅱ类群:杏5X-42、杏511、杏25;第Ⅲ类群:杏C、杏2、杏1(内蒙古)、X杏、农大杏(北)、杏丰68、杏3寿、L杏、杏B、杏9;第Ⅳ类群:杏6、杏3、杏528寿、杏丰12、DM2。其中杏1(辽宁)、杏1(内蒙古)分别聚在了不同的类群，说明这2株杏鲍菇菌株可能由于种植在不同的地区使得ITS序列存在着种内的变异，也可能是同名异种。遗传距离分析表明，20株供试菌的成对序列遗传距离范围为0.000 0～0.054 9，总体平均遗传距离为0.015 3，杏C与杏B，杏528寿与杏丰12，杏6与DM2，以及杏2与杏1(内蒙古)、农大杏(北)、杏丰68、杏3寿、L杏、杏9，这4组菌间的遗传距离为0，不存在遗传分化，应为相同菌株［19］;余下7株菌种(杏M、杏1(辽宁)、杏5X-42、杏511、杏25、杏3、X杏)间的遗传距离大于0，存在一定的遗传差距，因此经ITS序列初步分析，将收集到的20株菌种定为11个菌。

图4 基于ITS序列分析经N-J法构建的系统发育树Fig.4 TS sequence analysis of the system constructed by N-J method based on the phylogenetic tree

3 讨论

真菌的分类方法有很多，传统的分类方法包括形态学分类、生理学及生态学特征分类、血清学分类、真菌的菌体组成分类，由于真菌种类多、个体多态性明显，易受培养条件和其他因素的影响，且有些子实体难以获得，所以给真菌的分类鉴定带来了一定的难度。自DNA双螺旋结构提出以来，现代分子生物学技术得到迅速发展，由于DNA分子标记技术的结果不受外界环境因素和生长发育阶段的影响而直接反应鉴定菌株的遗传本质，显示其快速、准确的优越性，已广泛应用到各个领域。拮抗反应是菌株体细胞之间不亲和的表现［20］，通过拮抗实验可将供试菌株进行行为鉴定和分类。体细胞不亲和的2个菌株间一定存在遗传差异，因此菌株间的不亲和通常可以作为遗传差异的标记，亲和菌株可能完全相同就是一个菌株，也可能存在遗传差异。ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这种特点使ITS非常适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。

本实验通过拮抗实验将20株供试菌分为5个类群，其中第Ⅰ类群和第Ⅱ类群的结果与ITS序列分析相同，对于其余的15株菌，拮抗实验将杏丰68、杏528寿分别聚在2支，其余的13株菌聚在1支，而在ITS序列分析中却将这15株菌分为2个类群，这说明拮抗试验虽然是一种简易的鉴定方法，但受主观因素影响较大，特别是对拮抗强度的弱与无之间的界定，而且菌丝生长状况受外界环境的影响也很大，据报道，拮抗线的有无及程度的强弱还受培养基成分的影响［21］，因此拮抗反应只能作为鉴定菌种间亲缘关系的一个辅助手段，同时在实验过程中尽可能保证菌种传代次数、实验条件等影响因子的一致性，以减少实验误差。

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