一起兔产气荚膜梭菌病爆发流行及病原体的分离鉴定

寇 叙，刘永华，唐雨顺

(辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001)

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)广泛存在于土壤、人和动物肠道，可引起人和动物多种疾病。兔产气荚膜梭菌病(Clostridium welchii’disease)是由A型产气荚膜梭菌引起兔的一种以剧烈腹泻为特征的急性、致死性传染病［1］。除哺乳仔兔外，不同年龄、品种、性别的家兔对本菌均易感，1～3月龄仔兔发病率最高［2］。2012年4月初，辽宁省锦州市黑山县某兔场的几只仔兔突然出现发病、死亡现象，随后疫情逐渐扩大，1周内共有100只仔兔发病，发病率为50%(100/200);死亡65只，致死率为65%(65/100)。为此，对其进行了流行病学资料调查、临床症状和剖检病变观察、病原的分离与鉴定实验，同时对分离菌株进行药物筛选，选取敏感药物交替治疗，取得了一定的治疗效果，再无新病例发生，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 获取辽宁省锦州市黑山县某兔场病死兔10只，常规无菌操作，采集其胃、肠内容物、心血及心、肝、脾、肺、肾、肌肉、粪便等样本共50份。

1.1.2 培养基 普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、斜面营养培养基、血液琼脂平板、血液斜培养基均由实验室自制。

1.1.3 试剂 生化培养及药敏实验试剂购自沈阳联星试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 染色镜检 将无菌采取的心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织样本涂片，分别进行革兰和美兰染色镜检。

1.2.2 细菌分离培养 取胃、肠内容物、心血、粪便等样本匀浆后用少量灭菌生理盐水制成悬液分别接种于普通肉汤培养基中，37℃摇床常规及厌氧培养24 h。然后将肉汤培养液和组织样本接种于普通琼脂平板、血琼脂平板上，进行37℃常规及厌氧培养24 h。结果仅在厌氧培养条件下有细菌生长，挑取血琼脂平板上单个菌落转种于厌氧增菌培养基中，37℃增菌培养24 h。

1.2.3 生化试验 分别勾取分离菌纯培养物接种于糖类、肌醇、水杨苷［3］等生化试验培养基中，37℃培养24～48 h后判定结果。

1.2.4 致病性试验 将纯化好的分离菌接种到血液斜面培养基上，37℃厌氧培养18～24 h后制成菌悬液，并与麦氏浊管进行比浊，均选取浓度为30×108个活菌/mL分别腹腔注射2只昆明鼠，0.5 mL/只。同时应用0.22 μm细菌滤器分别对上述分离菌悬液过滤后各取滤液腹腔注射2只昆明鼠，0.5 mL/只，作为对照，观察结果。

1.2.5 药敏试验 分别用灭菌棉拭子蘸取致病性试验中选取浓度为30×108个活菌/mL的菌悬液［4］均匀涂布MH平板，经室温干燥3～5 min后，贴上药敏纸片，每块平板贴3片，37℃培养18～24 h，观察结果。判定标准参照美国实验室标准委员会(NCCLS)药敏纸片扩散法法规。

2 结果与分析

2.1 染色镜检

心、肝、肺、脾、肾、肌肉等样本涂片后革兰染色阳性，在镜下可见两端钝圆的粗大杆菌，单个存在，短链较少，无鞭毛，不能运动具有明显的荚膜，有的菌体中央或近端有芽胞，小于菌体横径(图1)。

图1 产气荚膜梭菌吉姆萨染色光镜照片Fig.1 Light microscope giemsa stained Clostridium perfringens

2.2 细菌分类培养

该菌仅在厌氧条件下生长为专性厌氧菌，肉汤培养液变浑浊并产生大量气体。在血琼脂平板上形成荚膜，无芽胞。菌落圆形、光滑、隆起、淡黄色、直径2～4 mm，有的呈圆盘形，边缘成锯齿状。菌落周围有棕色溶血区，呈辐射状条纹。

2.3 生化试验

通过与标准菌株进行生化特性对比，分离菌的生化试验结果与标准菌株相符(见表1)。

表1 菌落生化试验结果Table1 Bacterial colony biochemical test result

2.4 致病性试验

实验组小鼠在接种菌液后1 h，精神沉郁，48 h内2只小鼠先后死亡，对照组存活。剖检死亡小鼠可见腹膜、肠系膜充血。小肠段的黏膜充血、点状出血，部分糜烂;大肠段黏膜溃疡，部分黏膜脱落。采集实质脏器分离，分别分离到了与上述一致的革兰阳性大杆菌。对照组小鼠饲喂1周后仍健活。

2.5 药敏试验

比较抑菌圈直径结果表明，该菌株对氟苯尼考、头孢哌酮、哌拉西林、氨苄西林、萘啶酸、诺氟沙星、克林霉素等敏感，对红霉素、甲硝唑、头孢曲松、环丙沙星、呋喃妥因中度敏感，对氟哌酸、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、阿米卡星、呋喃唑酮等不敏感(见表2)。

表2 分离菌对18种抗生素的敏感性试验Table2 18 kind of antibiotic sensitivity test to bacteria

3 讨论

产气荚膜梭菌是一种梭状芽胞杆菌，属于条件性致病菌，是动物肠道中的常在菌群之一，广泛分布于自然界和畜舍环境中，可见于舍内空气、土壤、污水、饲料、食物和粪便。该菌可引起人食物中毒和家畜气肿疽，该菌也是引起畜禽猝死症、坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽的主要致病菌。兔是易感动物之一。兔产气荚膜梭菌病一年四季均可发生，以冬、春两季最为常见，即使是在饲养管理条件较好的兔场，也有该病的发生［5］。1979年我国首次在江苏省昆山种兔场发现兔的梭菌性下痢，至今已在江苏、山东、福建等20多个省市、自治区发现了兔产气荚膜梭菌病［6］。根据该兔场发病兔的临床症状和剖检变化可以初步诊断为细菌感染，经过多组织和脏器样本的涂片观察可见到典型的两端钝圆的粗大杆菌，单个存在，经分离培养和生化实验，结果均符合产气荚膜梭菌的特征，确定为产气荚膜梭菌，诊断该兔场发生了产气荚膜梭菌感染。兔产气荚膜梭菌病死亡症状与一些化学物质中毒有很多相似之处，容易被诊断为化学物质中毒。因此，必须做实验室诊断，通过细菌学、毒物学检查进一步确诊［7］。由于存在细菌耐药性问题，经药敏实验筛选合适的药物治疗，是十分必要的。此次分离菌株的敏感药物有氟苯尼考、头孢哌酮、哌拉西林、氨苄西林等，应用氟苯尼考治疗1周，取得了良好的治疗效果，再无新病例发生。

［1］付强，王艳，李峰.一株兔源魏氏梭菌的分离鉴定［J］.中国养兔，2008，(5):30-33.

［2］孙艳平，向钟平，包秀芬，等.肉兔病毒性出血症病毒与A型产气荚膜梭菌混合感染的诊断［J］.中国畜牧兽医，2010，37(10):215-216.

［3］王超，陈启和，倪辉，等.1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究［J］.微生物学杂志，2012，32(3):13-19.

［4］陈锐，李玥，韩丽萍，等.陕西定边盐湖嗜盐菌A393的分离及其种属鉴定［J］.微生物学杂志，2012，32(5):28-31.

［5］胡新岗，黄银云，金彩莲，等.犬源魏氏梭菌分离鉴定及药敏实验［J］.养殖与饲料，2007，(1):12-14.

［6］吴忆春.兔产气荚膜梭菌SD12株的分离与血清型鉴定［J］.中国畜牧兽医，2013，40(3):192-194.

［7］黄建华，陈松明.一例德国牧羊犬魏氏梭菌毒素中毒引起猝死的诊断报告［J］.畜牧与兽医，2013，45(2):109-110.