凝血因子、易栓症筛查三项及血管性血友病因子抗原的临床检测性能评价

寿玮龄，吴 卫，范连凯，谢 田，崔 巍

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科，北京 100730

·论 著·

凝血因子、易栓症筛查三项及血管性血友病因子抗原的临床检测性能评价

寿玮龄，吴 卫，范连凯，谢 田，崔 巍

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科，北京 100730

目的 对血栓与止血特殊项目的临床检测进行全面性能评价，以期为临床提供可靠的检测结果。方法 按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP5-A2、EP9-A2文件及《卫生部临床血液学检验常规项目分析质量要求WS/T 406-2012文件》标准，对本实验室ACL TOP 700全自动凝血分析仪测定凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、易栓症筛查三项(蛋白S、蛋白C及抗凝血酶-Ⅲ)和血管性血友病因子抗原(von Willebrand factor antigen, vWF:Ag)共12个项目的准确度、不精密度、携带污染率、线性、方法学比对及参考范围进行全面性能评估。结果 美国病理学家协会提供的12个项目质评物检测结果与靶值相比，除蛋白C低值外偏差均小于15%。8个凝血因子批内不精密度为1.7%～4.4%，均小于4.5%；批间不精密度为2.2%～7.5%，均不大于7.5%。易栓症筛查三项的批内不精密度为1.0%～7.0%；批间不精密度为1.5%～10.5%。vWF:Ag批内不精密度为2.2%～3.1%，批间不精密度为2.1%～4.1%。12个项目携带污染率为0～2.63%，均小于3%。线性验证实验结果显示蛋白S、蛋白C、抗凝血酶-Ⅲ及vWF:Ag相关系数为0.982～0.988，均≥0.975。ACL TOP 700与参比检测系统进行比较，12个项目检测结果的相关系数均≥0.975，一致性较好。厂商提供的参考范围均适用于本实验室。结论 ACL TOP 700全自动凝血分析仪对血栓与止血特殊项目检测的准确度、不精密度、携带污染率、现行线性范围及参考范围验证等性能评价良好，适用于临床标本检测。

凝血分析仪；血栓与止血；性能

MedJPUMCH,2014,5(3):278-282

ACL TOP 700全自动凝血分析仪是美国Instrument Laboratory公司生产的多参数凝血分析仪，可通过凝固法、发色底物法和免疫比浊法进行检测。本实验室根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)EP5-A2和EP9-A2文件[1- 2]，以及《卫生部临床血液学检验常规项目分析质量要求WS/T 406- 2012文件》要求，全面验证即将投入使用的ACL TOP 700全自动凝血分析仪性能，以评估该仪器对凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、血管性血友病因子抗原(von Willeband factor antigen，vWF:Ag)和易栓症筛查三项：蛋白S(protein S, PS)、蛋白C(protein C, PC)、抗凝血酶-Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)等血栓与止血特殊项目的检测是否可以用于临床标本的检测。

材料和方法

仪器与试剂

ACL TOP 700全自动凝血分析仪及其配套试剂、定标品与质控品为美国Instrument Laboratory公司产品，STA-R全自动凝血分析仪及其配套试剂与质控品为法国Diagnostic Stago公司产品。

标本

枸橼酸钠(109 mmol/L)抗凝新鲜静脉血标本，抗凝剂与标本比例为1∶9，在1500×g下离心10 min，取上层血浆，在2 h内完成检测，或于-80 ℃分装冻存，冻存标本检测前于37 ℃水浴15 min快速复温。标本无溶血、凝固、乳糜现象，红细胞比容<55%。

测定方法

凝血因子及PS测定方法为凝固法，PC、AT-Ⅲ为发色底物法，vWF:Ag为免疫比浊法。

评估指标

准确度：采用美国病理学家协会(College of American Pathologists, CAP)室间质评物(CGE-A)进行单次检测，计算每份样本检测结果与靶值间的相对偏差。相对偏差(%)=(测定值-靶值)/靶值×100%。

携带污染率(carryover rate, CR)：取高值临床样本一份，连续测定3次；再取低值临床样本一份，连续测定3次。将测定结果记为H1、H2、H3和L1、L2、L3，按公式CR=|L1-L3|/(H3-L3)×100%计算。

线性验证：取高浓度混合血浆(H)、低浓度混合血浆(L)各一份，按5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L配成6个浓度梯度的混合血浆，按浓度从低到高各测定2次。其预期浓度按照公式：x=(CL×VL+CH×VH)/(VL+VH)计算。按照CLSI EP6-A文件提供的方案初步检查数据，检查离群值，判断重复性，根据检测结果进行线性回归分析。之后进行多元线性回归，将结果分别拟合一次、二次、三次多项式，并进行评价。判断标准：线性回归方程的斜率在1±0.05范围内，相关系数r≥0.975。

比对：收集40例不同浓度血浆标本，凝血因子与外院同型号仪器进行比对，PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag分别在评估仪器和STAGO系统上进行比对。参考CLSI EP9-A2文件提供的方案，分别以参比仪器测定结果为X，以评估系统测定结果为Y，绘制散点图及偏倚图，目测评价，显示回归方程Y=a+bX，同时评价不同检测系统的平均百分偏差、相关系数(r)。

参考范围验证：收集40例表观健康人枸橼酸盐抗凝静脉血，覆盖各年龄段，男女比例各半。测定待验证项目，将检测结果按照大小排序并计算极差R，然后分别计算最大值和最小值与其相邻数值之差D；若D/R≥1/3，则将最大值或最小值视为离群值予以剔除；将余下数据重复前述步骤进行离群值检验，直至剔除所有离群值。同时应另外选择符合要求的个体以补足40例，确保检测结果不含离群值。判断标准：将40个验证数据与参考区间进行比较，超出参考区间的数据≤4个(即超出参考区间的检测数据个数≤10%)时，验证通过。其中，vWF:Ag参考范围按照O型与非O型血型分别进行验证。

统计学处理

使用SPSS 17.0软件完成相关分析、回归分析、重复测量方差分析及一致性检验，检验水准α=0.05。

结 果

准确度

CAP质评物检测结果与靶值相比，除PC低值外，其余各项相对偏差均小于15%(表1)；12个项目检测结果均在CAP回报给定允许范围内。

不精密度评价

8个凝血因子批内不精密度及批间不精密度≤7.5%；易栓症筛查三项批内不精密度为1.0%～7.0%，批间不精密度为1.5%～10.5%；vWF:Ag批内不精密度为2.2%～3.1%，批间不精密度为2.1%～4.1%(表2、3)。

携带污染率

凝血因子携带污染率为0.11%～2.63%，易栓症筛查三项携带污染率为0～1.12%，vWF:Ag携带污染率为0.33%，均小于3%。

线性

PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag数据组中无明显离群值，最佳拟合方程为一次多项式，回归方程中b在0.99～1.03之间，a与0差异无统计学意义(P>0.05)；相关系数在0.982～0.988之间，均≥0.975。其中AT-Ⅲ预测值与实测值见图1。

表 1 凝血因子、易栓症筛查三项和vWF:Ag准确度结果

PS：蛋白S；PC：蛋白C；AT-Ⅲ：抗凝血酶-Ⅲ；vWF:Ag：血管性血友病因子抗原

表 2 凝血因子八项批内不精密度及批间不精密度

CV：变异系数

表 3 易栓症筛查三项及vWF:Ag批内不精密度及批间不精密度

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1；CV：同表2

方法学比对

凝血因子检测在同系统间，易栓症筛查三项、vWF:Ag检测在不同系统间比较，r均≥0.975，不同仪器系统间一致性较好，平均百分偏差(%)除FⅤ(15.5%)及AT-Ⅲ(15.2%)外均小于15%(表4)。

图 1 AT-Ⅲ线性验证

项目r偏差(%)凝血因子FⅡ0.993-8.5FⅤ0.98315.5FⅦ0.9983.7FⅧ0.9753.9FⅨ0.993-12.6FⅩ0.998-11.7FⅪ0.9897.7FⅫ0.9907.4易栓症筛查三项PS0.9753.5PC0.9933.3AT-Ⅲ0.98315.2vWF:Ag0.9759.3

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1

参考范围验证

40例表观健康人12个项目检测结果均有大于等于90%在试剂说明书提供参考范围内。其中，20例O型表观健康人vWF:Ag检测结果为48.4%～202.3%，2例超出范围(41.1%～125.9%)；20例A+B+AB型表观健康人vWF:Ag检测结果为57.7%～203.8%，2例超出范围(61.3%～157.8%)。

讨 论

凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)活性和易栓症筛查(PS、PC、AT-Ⅲ)项目是进一步确诊凝血系统和抗凝系统相关疾病的实验，vWF:Ag是血管性血友病诊断的重要指标；同时出凝血机制异常也与肿瘤等其他疾病的发生发展密切相关[3]，血栓与止血特殊项目检测具有十分重要的临床意义。良好的检测系统是准确结果的保证，国内尚未见血栓与止血特殊项目性能验证的相关文献报道，国外文献亦未见全面项目的相关报道。

本研究验证的12个项目的CAP质评物检测结果均在CAP回报范围内，除PC低值外，其余各项与靶值相比偏差均小于15%。在CAP回报结果中仅FⅧ、FⅨ和AT-Ⅲ三项进行了检测系统区分，其余各项为全球所有实验室回报结果计算均值，可能会使偏差大于同系统间的实际偏差。同时，《WS/T 406-2012文件》规定准确度验证应至少使用5份质评物，但现有CAP质评物仅2份，需进一步完善评价结果。

本研究批内与批间不精密度与国外文献报道基本一致[4]，但PS批内不精密度、批间不精密度高于其他项目，这与其试剂稳定性有关。PS测定试剂的机上有效时间为1 h，乏PS血浆的机上有效时间为4 h，且试剂配制过程对检测结果影响较大，提示在常规工作中需注意PS相关检测试剂的配制及使用时间，减少因试剂原因导致的检测结果假性降低。必要时可在检测过程中增加质控频次，以保证检测结果的准确性。同时，实验室工作人员应明确本实验室所检测的PS抗原为血浆中总PS还是游离PS。

ACL TOP 700与运行良好的其他检测系统进行比较，12个项目检测结果的相关系数r均≥0.975，一致性较好。文献报道凝血功能分析的系统差异仅见于凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原等初筛项目[5]，少有特殊项目的分析。不同检测系统间APTT试剂激活剂种类的不同(鞣花酸、硅藻土)可影响FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ的检测结果；检测原理的不同如磁珠法还是光学法，散射光还是透射光，也会影响到检测结果[6]。对于不同的检测系统，提高对试剂性能和溯源性的要求，有利于减少系统间差异。

厂商试剂说明书提供的参考范围均适用于本实验室。需注意的是vWF:Ag参考范围应按血型划分[7]，不可笼统只取一个参考范围，在临床诊断血管性血友病过程中要充分考虑ABO血型系统对vWF:Ag的影响。

综上，ACL TOP 700全自动凝血分析仪血栓与止血特殊项目检测携带污染率、现行线性范围及参考范围验证等性能评价良好，适合临床标本检测。本研究性能验证数据与国外文献基本一致，但目前血栓与止血特殊项目准确度和不精密度性能验证及比对等要求国内外均无相关标准，还需相关组织进一步完善和确认上述项目的性能验证标准。

[1]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods; Approved guideline. EP5-A2 [S]. Wayne, PA: NCCLS, 2004.

[2]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; Approved guideline. EP9-A2 [S]. Wayne, PA: NCCLS, 2002.

[3]寿玮龄,崔巍.恶性肿瘤出凝血异常机制[J].协和医学杂志, 2012, 4: 482- 486.

[4]Appert-Flory A, Fischer F, Jambou D, et al. Evaluation and performance characteristics of the automated coagulation analyzer ACL TOP [J]. Thromb Res, 2007, 120:733- 743.

[5]王海,王成彬,齐晓伟，等.凝血功能分析的系统差异性对临床决策的影响探讨[J].中华临床医师杂志, 2012, 6: 4371- 4374.

[6]Bai B，Christie DJ，Gorman RT, et al. Comparison of optical and mechanical clot detection for routine coagulation testing in a large volume clinical laboratory[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2008, 19: 569- 576.

[7]Dentali F, Sironi AP, Ageno W, et al. ABO blood group and vascular disease: an update[J]. Semin Thromb Hemost, 2014:49- 59.

Performance Evaluation of Clinical Detection of Coagulation Factors, Protein S,Protein C, Anti-thrombin Ⅲ, and von Willebrand Factor Antigen

SHOU Wei-ling, WU Wei, FAN Lian-kai, XIE Tian, CUI Wei

Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

CUI Wei Tel: 010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

Objective To conduct a comprehensive performance evaluation of fully automated coagulation analyzer in testing coagulation factors, protein S(PS), protein C(PC), anti-thrombin Ⅲ (AT-Ⅲ), and von Willebrand factor antigen (vWF:Ag). Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP5-A2, EP9-A2, and WS/T 406-2012 specifications, coagulation factors(FⅡ, FⅤ, FⅦ, FⅧ, FⅨ, FⅩ, FⅪ, and FⅫ), PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were detected in the apparatus to evaluate the accuracy, within-run and between-run imprecisions, linear range, carryover rate, method comparisons, and reference range of the ACL TOP 700 coagulation analyzer. Results The instrument had high accuracy and precision, a good linear range, and low carryover rate (0-2.63%, <3%). The biases of the 12 College of American Pathologists (CAP) controls compared with the target value were all less than 15%, excepting the low value of PC. The within-run imprecisions of 8 coagulation factors were 1.7%-4.4%, and the between-run imprecisions were 2.2%-7.5%. The within-run imprecisions of 3 thrombophilia screen tests and vWF:Ag were 1.0%-7.0% and 2.2%-3.1%, and he between-run imprecisions were 1.5%-10.5% and 2.1%-4.1%, respectively. The carryover rates of the 12 items ranged from 0 to 2.63%. Results of liner verification test showed the correlation coefficients of PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were 0.982-0.988. Results of method comprisons showed the correlation coefficients of ACL TOP 700 and other coagulation analyzer were more than 0.975, and the recommended reference ranges of all the 12 items were appropriate for our laboratory. Conclusions ACL TOP 700 coagulation analyzer has a good performance in accuracy, imprecision, carryover rate, linear range, and method comparison. It is suitable for detection of clinical specimens.

coagulation analyzer; thrombosis and homeostasis; performance

崔 巍 电话：010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

R446.11

A

1674-9081(2014)03-0278-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.007

2014- 05- 04)