维药迪娜口服液对急性肝损伤小鼠肝脏组织MDA、GSH-Px含量及Ca2+-ATPase活性的影响

方正清， 贾鹏鹏， 许 闪， 王桐生， 吾布力·吐尔迪

(安徽中医药大学1护理学院， 2药学院， 3中西医结合临床学院, 合肥 230038； 4新疆维吾尔医学专科学校药学系, 新疆 和田 848000)

迪娜口服液(新药制字Z04000139)是维吾尔医学专科学校研制的口服液制剂，其主要成分为菊苣子、菊苣根、旱芹菜子、大黄、菟丝子、菟丝草、小檗实及青香茅等10味药材组成，具有保肝降酶、开塞通络、增强肝胆功能的功效，对各种肝病治疗具有肯定疗效。李迪明等[1]研究已发现迪娜口服液可降低四氯化碳(CCl4)所致肝损伤酶的升高和保护肝组织，但其机制不明。汤新慧等[2]研究报道CCl4所致肝损伤中肝细胞发生凋亡是重要机制，凋亡又与氧化应激密切相关。因此，本研究探讨迪娜口服液对CCl4所致肝损伤时氧化应激的作用，为CCl4所致肝损伤的机制和防治提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组昆明种小鼠60只,雌雄各半,分开饲养，SPF级，体质量18～22 g，购自安徽省实验动物中心[动物合格证号：SCXK(皖)2011-002号]。小鼠适应性喂养5 d，自由摄食和饮水，温度保持18～20℃，相对湿度40%～60%，定时通风换气。随机分成6组，称重、标记并记录，每组10只，6组分别为正常对照组、模型组、阳性药联苯双酯组(3.75 mg/kg,相当于人10倍用量[3])及迪娜口服液低、中、高剂量组(分别为4.78、9.55、19.10 g迪娜口服液/kg体质量，相当于人用量95.5 g/d 的5、10、20倍)。

1.2药品与仪器四氯化碳(CCl4) (分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司，批号20091216)，植物油(山东鲁花花生油股份有限公司)，迪娜口服液(新疆新维制药厂，批号20100201)，联苯双酯滴丸(北京协和药厂，批号10120104，1.5 mg/丸，5丸/次，3次/d)，生理盐水(安徽丰原药业，批号121105K2)，考马斯亮蓝试剂盒(批号 20130126)、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(批号20130220)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量测定试剂盒(批号20130216)、Ca2+转运ATP酶(Ca2+-ATPase) 试剂盒(批号 20130214)均购自南京建成生物工程研究所，冰乙酸(分析纯AR，上海振企化学试剂有限公司，批号20100622)，无水乙醇(上海化学试剂一厂，批号20100105)。UV-754分光光度计(上海第三分析仪器厂)，TDZS-WS多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，电子台秤(上海佑科仪器仪表有限公司，编号11076040)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂，型号WSZ-133-65)。

1.2方法

1.2.1 急性肝损伤模型建立与处理[4]0.15%四氯化碳-花生油溶液的制备：精密量取0.15 mol/L CCl4于100 mL的容量瓶中，加花生油定容、塞紧瓶塞、倒置、混匀后即可用于实验。将小鼠适应性喂养5 d后，开始实验当日起，各实验药物组及阳性对照组每天分别灌胃给药，正常对照组、模型组灌胃等体积双蒸水。给药期间自由饮水，普通饲料饲养。连续给药7 d后，禁食不禁水12 h，各药物组及模型组腹腔注射0.15%CCl4-花生油溶液，剂量为0.1 mL/10 g体质量，正常对照组腹腔注射等体积花生油。

1.2.2 肝脏标本的采集及组织匀浆的制备[5]造模24 h后，脱颈椎处死动物，于同一部位摘取部分肝脏，-20℃保存，用于肝组织匀浆的制备。取保存的肝脏组织块(0.2～1 g)用冰冷的生理盐水解冻，漂洗，除去血液，滤纸吸干，称重，放入5～10 mL的烧杯中。用量筒取9倍组织重量且预冷的生理盐水，用移液管将总量2/3的生理盐水移入烧杯，用眼科小剪尽快剪碎组织块并倒入玻璃匀浆管中，再用剩下的1/3的生理盐水冲洗残余在小烧杯的碎组织一起倒入匀浆器中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水的器皿中，右手将杆垂直插入套管中上下转动研磨数10次(6～8 min)，充分磨碎，使组织匀浆化。

1.2.3 MDA含量的测定 采用比色法(TBA法)，因脂质过氧化产物中的MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收,故选用532 nm处测定其吸光度，算出MDA含量。(1)组织蛋白含量的测定：取上述10%肝脏匀浆，按考马斯亮蓝试剂盒说明测定蛋白含量。(2)取上述10%肝组织匀浆，按照丙二醛测试盒说明测定各管OD值。(3)参照试剂盒说明书，将测定的OD值带入组织中MDA含量计算公式①中计算各组MDA含量。

①

1.2.4 GSH-Px活力测定 采用比色法，因GSH-Px和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412 nm处测定其吸光度即可算出GSH-Px含量。(1)组织蛋白含量的测定：取上述10%肝脏匀浆，按考马斯亮蓝试剂盒说明测定蛋白含量。(2)将上述制备好的10%肝组织匀浆，离心，留上清液。按照GSH-Px测试盒说明测定各管OD值。(3)参照试剂盒说明书，将测定的OD值带入组织中GSH-Px含量计算公式②中计算各组GSH-Px含量。

②

1.2.5 肝组织Ca2+-ATPase活性变化 采用比色法，ATP酶可以分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷含量可判断ATP酶活力。(1)组织蛋白含量的测定：取上述10%肝脏匀浆，按考马斯亮蓝试剂盒说明测定蛋白含量。(2)将上述制备好的10%肝组织匀浆，稀释，按照Ca2+-ATPase测试盒说明测定各管OD值。(3)参照试剂盒说明书，将测定的OD值带入组织中Ca2+-ATPase含量计算公式③中计算各组Ca2+-ATPase含量。

③

2 结果

与正常对照组比较，模型组肝组织MDA含量明显升高，GSH-Px活力明显降低(P<0.05)，Ca2+-ATPase活性显著降低(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组和迪娜各剂量组肝组织MDA含量均降低，其中迪娜高剂量组降低明显(P<0.05)；GSH-Px各剂量组活力提高，其中高剂量组上升较为明显；阳性对照组和迪娜各剂量组Ca2+-ATPase均有较大幅度的上升(P<0.05)，其中迪娜中剂量组Ca2+-ATPase活性增幅最大(P<0.01),见表1。

表1 迪娜口服液对急性肝损伤模型小鼠肝组织MDA含量、GSH-Px及Ca2+-ATPase活力的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，▲P<0.05。

3 讨论

有研究表明，CCl4引发的急性肝损伤产生过量的自由基可广泛地损伤肝细胞，导致肝细胞坏死、肝脏脂质大量积蓄进而导致MDA含量显著变化[6]。这使得MDA 与细胞内生物大分子交联的机会变大，从而使得胞质、线粒体、微粒体内的各种酶活性被抑制，肝细胞因自由基造成的氧化损伤最后导致肝细胞坏死[7]。MDA是脂质过氧化最终产物，其含量与脂质过氧化反应成正比，其含量可间接反映肝细胞损伤的程度。CCl4代谢产生的活性自由基CCl3-以及由其诱导产生的氧自由基，能使细胞膜、线粒体膜、微粒体膜等生物膜上的脂质过氧化链式反应启动，细胞内脂质过氧化产物MDA的含量增加，GSH-Px活性亦有变化。肝组织匀浆脂质过氧化产物MDA含量明显增加，抗氧化物酶GSH-Px活性显著降低，表明CCl4引起急性肝损伤的机制与脂质过氧化有关[8]。本实验结果表明，CCl4致急性肝损伤模型小鼠组肝组织MDA含量较正常对照组有较大幅度的上升，而肝组织GSH-Px活力与Ca2+-ATPase活性有很大程度的下降。GSH作为脂质过氧化物的清除剂，可稳定细胞辅助因子,保护肝细胞。MDA含量的增加和GSH-Px活力的抑制提示CCl4致小鼠急性肝损伤的机制为引起脂质过氧化反应，而Ca2+-ATPase活性的抑制也提示此过程的发生。迪娜各剂量组的肝组织MDA含量较模型组均有所下降，GSH-Px活力与Ca2+-ATPase活性均有所上升。其中，迪娜中、高剂量组肝组织MDA含量下降较为明显，说明迪娜口服液中、高剂量对CCl4致急性肝损伤小鼠脂质过氧化损伤抑制作用较明显；迪娜高剂量组GSH-Px活力上升较为明显，说明此剂量的迪娜口服液对CCl4致急性肝损伤小鼠的脂质过氧化物的清除作用较强，提高GSH-Px活力保护肝细胞较好；迪娜中剂量组Ca2+-ATPase活性较其他实验药物组活力高，与正常对照组Ca2+-ATPase活性水平较为接近，说明该剂量的迪娜口服液在提高Ca2+-ATPase活性恢复受损肝细胞方面具有较好的作用。

研究认为，受损肝细胞内转氨酶的释放，使得血清中转氨酶升高成为肝脏损伤程度的重要指标[9]。本课题组的前期研究工作显示，迪娜口服液对CCl4致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用，不同剂量的迪娜口服液能抑制CCl4致急性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的升高[10]，提示CCl4致急性肝损伤模型的成功。

本实验结果显示迪娜口服液对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织MDA含量升高有一定的抑制作用，对肝组织GSH-Px活性及Ca2+-ATPase活力均有一定恢复作用，提示迪娜口服液对肝损伤保护的过程可能与其抗氧化作用有关。其通过降低肝过氧化物含量、提高相关抗氧化酶活性从而清除自由基，防止脂质过氧化，稳定细胞膜结构，起到保护肝细胞的作用。本研究结果为迪娜口服液临床进一步应用和开发提供了一定的佐证。迪娜口服液对肝脏疾病的保护作用可能是参与肝脏脂质过氧化过程，具体机制需进一步探究。

参考文献：

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