HPLC法测定牛至中迷迭香酸的含量

李 明， 李建光, 王东东， 丁文欢， 周晓英

(新疆医科大学1第六附属医院药剂科， 乌鲁木齐 830002, 2药学院, 3中医学院, 乌鲁木齐 830011)

牛至为唇形科植物牛至(OriganumvulgareL.)的干燥全草，维吾尔语名为“尖比力”， 别名通常有土香薷、小叶薄荷、止痢草等，夏秋二季花开时采收，除去杂质，晒干。维吾尔医认为牛至能消散寒气，开通湿阻，清涤异常体液，利尿通经，增强营养吸收，用于粘稠异常体液性咳喘、感冒、头痛、脉络闭阻性胸闷气短、形体消瘦、心烦神疲、食欲不振、尿少肢肿[1]。牛至在新疆主要分布于天山、阿勒泰山、准噶尔西部的山地草甸、林缘、河谷、亚高山草原及河谷[2]，以及河南、甘肃、湖北、陕西等省区，国外主要分布于地中海地区、中亚、北非、北美等地。牛至性凉，味辛，无毒，有清热解表、利水消肿的功效，主治中暑、感冒、头痛身痛、急性胃肠炎、腹痛吐泻、水肿等[3]。

牛至含有挥发油类、黄酮类、三萜类、有机酸类等化学成分[4-5]。薄层色谱定性实验表明，牛至中含有迷迭香酸，且含量较高。迷迭香酸具有多方面的药理作用，如清除自由基、抗炎和免疫调节、抗血栓和抗血小板凝集、抗病毒和抗菌、抑制肾小球系膜细胞的增殖、抗抑郁等[6]。本研究以迷迭香酸为指标成分，参考文献[7-8]，采用高效液相色谱法测定其在牛至中的含量，为提高牛至的药品标准提供定量的数据支持。

1 仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪LC-6AD、CBM-20A色谱工作站、SPD-20A型紫外检测器、 SIL-20A型自动进样器、CTO-10ASvp型柱温箱(日本岛津公司)，XS105型电子天平(德国梅特勒-托利多公司)。

1.2样品与试剂甲醇为色谱纯，其他均为分析纯，水为娃哈哈饮用纯净水，迷迭香酸对照品(sigma-ALDRICH，批号：CFAE-536954-5G)。牛至全株采集于新疆昌吉、伊犁地区，由新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任药师鉴定为唇形科植物牛至(OriganumvulgareL.)，阴干，粉碎，即得供试样品。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱: Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，流动相：甲醇-1.5%乙酸水(38∶62)，检测波长330 nm，柱温25℃，流速1.0 mL/min。在上述色谱条件下，迷迭香酸与供试品中其他组分色谱峰可达到基线分离，分离度良好，迷迭香酸峰理论塔板数不低于2 000，迷迭香酸及牛至供试样品色谱图见图1。

A: 迷迭香酸对照品;

B:牛至供试样品(a:迷迭香酸对照品)

2.2对照品溶液的制备精密称取11.07 mg迷迭香酸对照品，用甲醇定容于25 mL棕色量瓶中，分别取1.5、3、4.5、6、7.5 mL，用甲醇定容于10 mL棕色量瓶中，制成一系列不同浓度的溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称定干燥牛至药材粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，称定重量，浸泡30 min，超声提取(功率150 W, 频率60 KHz)30 min，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4线性关系考察精密吸取迷迭香酸对照品溶液5 μL进样分析，以对照品浓度(X，mg/mL)为横坐标，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得迷迭香酸线性回归方程为Y=13 602 333.63X-52 022.80(r=0.999 9)，结果表明，迷迭香酸进样量在0.332 1～1.660 5 μg范围内，峰面积与进样量呈现良好的线性关系。

2.5精密度试验精密吸取迷迭香酸对照品溶液5 μL，连续进样6 次，结果齐迷迭香酸峰面积RSD值为1.15%，表明精密度较好。

2.6稳定性试验取同一牛至供试品溶液(3号样)，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样5 μL测定，结果迷迭香酸峰面积的RSD值为2.19 %，表明供试品溶液在24 h内基本稳定，峰面积没有在考察时间内呈现下降趋势。

2.7重复性试验精密称取牛至药材粉末6 份(6号样)，按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试液，并在上述色谱条件下进样5 μL，测定迷迭香酸峰面积，计算含量。结果供试品中迷迭香酸含量的RSD值为1.69 %，表明实验方法的重复性较好。

2.8加样回收率试验分别精密称取6份已知含量牛至药材粉末(6号样)0.25 g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，精密称取迷迭香酸对照品21.91 mg置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。每个具塞锥形瓶中分别准确对照品4 mL和甲醇21 mL，按“供试品溶液的制备”项下方法制成供试液，在上述色谱条件下进样5 μL测定，结果平均回收率为98.96%，RSD=1.09%，见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9样品含量测定精密吸取供试品溶液5 μL分别注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，每样平行测定5份，计算样品中迷迭香酸的含量，结果10个产地的迷迭香酸含量为8.13～15.74 mg/g，见表2。

表2 样品含量测定结果(n=5)

3 结论

牛至油是牛至的主要有效成分，具有抑菌杀菌作用，近年来多用于饲料添加剂。但本实验测定的10批样品均产自新疆，挥发油提取实验结果表明，挥发油含量极少，不适宜作为提高药品标准的定量指标；而有机酸类成分迷迭香酸在所有批次样品中均有检出，含量为8.13～15.74 mg/g，且具有显著的生物活性，故将迷迭香酸定为定量检测指标。

高效液相色谱法测定牛至中的迷迭香酸，样品处理简单，分离度较好，测定迅速，为牛至药材的开发提供依据。

参考文献:

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准:维吾尔药分册[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社, 1999.

[2] 新疆植物志编辑委员会. 新疆植物志:第四卷[M]. 乌鲁木齐:新疆科学技术出版社, 2004:333．

[3] 孙丽娟,刘红兵,许汉林,等.湖北产牛至药材中香荆芥酚和麝香草酚的含量测定[J].中药材, 2005, 28(7):562-563.

[4] 李俊杰,,李蓉涛.牛至的研究现状[J].光谱实验室, 2013, 30(1):171-175.

[5] 孙丽娟,刘红兵,范文乾,等. 牛至的化学成分研究(I) [J].中草药, 2007, 38(12):1782 -1785.

[6] 吴建章,郁建平,赵东亮,等. 迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发, 2005, 17(3):383-388.

[7] 方颖,刘焱文.高效液相色谱法测定不同产地牛至药材中对-聚伞花素的含量[J].中国医院药学杂志, 2006, 26(4):428-430.

[8] 关新莉,李洁,王东东,等. HPLC 法测定异叶青兰中迷迭香酸的含量[J].新疆医科大学学报, 2013, 36(9):1284-1286.