IMRT对新疆大鼠继发性骨棘球蚴杀灭效果的实验研究

樊勤学， 徐江波， 袁 宏， 周文正， 孙俊刚， 赵喜滨， 王 浩， 徐万龙

(新疆维吾尔自治区人民医院骨一科， 乌鲁木齐 830001)

棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病(Hydatid Disease)，是指由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球绦虫(E.oligarthrus)、寡节棘球绦虫(E.oligarthrus Diesing)和福氏棘球绦虫(E.vogeli Rausch &Bernstein)的幼虫在人畜之间相互传染的寄生虫病，严重危害全球人类的健康。我国包虫病的发病率很高[1]，尤其是地处边疆的新疆[2-3]。骨包虫在人体各脏器包虫病的发病率位居第3位，肝脏和肺脏的包虫病发病率则位居第1、2位。临床上针对骨包虫的治疗仍然以手术为主，但由于骨松质的存在，骨包虫的复发率很高。而由于药物在骨包虫囊内的浓度极低，所以药物治疗效果差。采用三维适形调强放疗(IMRT)对骨包虫实施根治性、无侵入性放疗，是一种较为理想的治疗方法，但迄今IMRT对骨包虫的杀灭效果、可能的机制人们仍知之甚少，目前尚无成熟的报道。为观察IMRT对新疆大鼠继发性骨棘球蚴的杀灭效果，本研究通过对骨包虫病大鼠骨棘球蚴病灶区实施IMRT，检测骨棘球蚴包囊中细胞凋亡情况及凋亡相关基因Caspase-3的表达情况，以期为临床上将IMRT用于骨包虫的治疗提供实验室证据。

1 材料与方法

1.1实验动物选用中国武警总医院实验动物实验室提供的双侧股骨继发性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。将骨包虫大鼠先行X线及CT检查，均提示股骨继发性棘球蚴接种成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯卧位摆置于自制的放疗体膜内，并稳定固定。采用飞利浦Mx8000多层螺旋CT扫描机对左侧股骨棘球蚴病区进行扫描，扫描密度为1 mm/层。将收集的数据上传到Somavison系统内，进行信息重建，并将周围的血管、肌腱、神经、皮肤勾画为需要保护的器官。勾画完放疗区域后，利用三维适形调强放疗仪的计算机计算系统对骨包虫区域的放射剂量及剂量分布均匀程度按照放疗计划进行分析和计算。经专业放射物理师在14 d内，对50只大鼠左侧股骨骨棘球蚴病区分别给予40 Gy剂量的IMRT治疗，右侧股骨只给予假照射作为阴性对照。

1.2取材将经IMRT放射治疗后的棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，空气栓塞活杀处死，在显微镜下取出双侧股骨骨髓腔内的骨包虫的包囊，经甲醛、戊二醛浸泡后低温保存。

1.3电镜检测将标本经戊二醛、锇酸处理后的包虫组织进行浸泡后用缓冲液进行反复冲洗，采用阶梯浓度的医学酒精进行反复脱水处理，再次用缓冲液进行反复冲洗，浸泡于丙酮中进行低温保存。标本采用环氧树脂、固化剂等进行浸泡后包埋并烘干，对组织块进行休整并切片后铺于金属铜网表面，依次进行枸橼酸铅、醋酸铀的染色。通过电镜对接受放疗后骨棘球蚴包囊细胞的形态学进行观察。

1.4RT-PCR检测Caspase-3基因上下游引物序列为F： 5′AGATCACAGCAAAAGGAGCAGT3′；R：5′TCAAGCTTGTCGGCATACTGT3′。将骨棘球蚴病的组织采用液氮进行研磨，装入含有Trizol的离心管中，将其充分混匀、裂解、沉淀并澄明，加入氯仿后混匀，加入异丙醇并混匀，离心后弃上清，加入乙醇后沉淀，弃上清后将沉淀进行保留、干燥。加入DEPC后溶解，进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分析测定。将骨棘球蚴的Caspase-3的RNA从-80℃冰箱取出，解冻后组配逆转录反应的体系。在PCR仪上加少量冰进行冷却，加入Frist-Strand Buffer、RNasin、TIANScript M-MLV、Total Volume，将以上体系进行配比后离心，在PCR仪上加温并终止反应，冷却后进行稀释。配制PCR反应体系，调节ABI7500荧光定量PCR循环条件。对结果进行分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，以 GAPDH 为内参照基因，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)，将RQ值用于统计学分析。

2 结果

2.1透射电镜观察IMRT对骨包虫的杀灭效果透射电镜结果提示，未接受放疗鼠骨棘球蚴包囊细胞正常形态存在，细胞膜未出现破裂，胞质内细胞器形态完整，细胞核居中，无固缩(图1)。经放射治疗后的骨包虫的囊壁可见大量的变性坏死，生发细胞大量减少，细胞板层结构受损、出现层列，间隙间可见空泡样改变，甚至一些细胞直接出现崩裂样状态，无法分辨正常的细胞形态。所有正常细胞形态消失，细胞胞质排列疏散，线粒体变粗肿胀，线粒体内嵴拥挤、断开，内质网脱颗粒样改变、疏松，细胞核崩裂、固缩，可见凋亡小体(图2)。

图1 未接受放疗骨棘球蚴包囊细胞(电镜8 000倍)

图2IMRT放疗后骨棘球蚴包囊细胞(电镜8000倍)

2.2RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3的表达情况RT-PCR法检测发现，经IMRT作用后的左侧股骨棘球蚴包囊细胞凋亡相关基因Caspase-3大量表达，Caspase-3 mRNA 的RQ值为(67.39±17.35)。但未接受IMRT治疗的右侧股骨棘球蚴病区棘球蚴包囊细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达极少量，Caspase-3 mRNA 的RQ值为(1.43±0.53)，左侧与右侧股骨棘球蚴病区棘球蚴包囊细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达差异具有统计学意义(t=7.984，P<0.05)。

3 讨论

自1996年美国纽约的Memorial Sloan-Kettering Cancer Center首先发表文章阐述适形调强放射治疗技术至今，IMRT已有15 a的发展历史。IMRT是通过计算机来控制射线的方向，可将精确的、剂量高的射线集中在医者所关心的病变组织区域，而周围组织很少受到射线的损伤，所以IMRT是现有临床上一种可靠的、精度高的放射治疗方法，受到学者的推崇。根据IMRT对肿瘤细胞有很高的杀灭作用，笔者认为IMRT对骨包虫的细胞也应该有很好的杀灭作用。故本研究通过对骨包虫病实施IMRT，通过电镜对接受放疗后骨棘球蚴包囊细胞形态学进行观察，结果表明经放射后的骨包虫的囊壁可见大量的变性坏死，所有正常细胞形态消失，细胞胞质排列疏散，线粒体变粗肿胀，线粒体内嵴拥挤、断开，内质网脱颗粒样改变、疏松，细胞核崩裂、固缩，可见凋亡小体，以上显微镜下所观察到的现象均为放射性骨坏死典型的病理改变，所以本研究认为IMRT可以集中射线，局部高能杀灭骨包虫，而且放射线可彻底清除深藏于松质骨、骨小梁中间的骨包虫头节，降低骨包虫残留率、复发率。本研究表明，骨棘球蚴包囊细胞对IMRT的射线敏感，IMRT对骨棘球蚴包囊细胞有较明显的杀伤作用，以上结果与IMRT临床上直接应用于多数肿瘤细胞的实验结果相同[4-6]。

本实验证明了IMRT对杀灭骨棘球蚴病有很好的效果，IMRT可促进新疆大鼠继发性骨棘球蚴包囊细胞的凋亡。IMRT对杀灭骨棘球蚴有2条途径[4-6]：(1)直接损伤效应：指组织细胞的关键生物大分子直接吸收射线的能量所造成的损伤；(2)间接损伤效应：指生物大分子及其周围的其他分子(主要为水分子)在吸收射线的能量后产生大量的氧自由基，继而发挥对关键生物大分子的损伤效应。其中DNA是电离辐射作用的主要靶分子之一，电离辐射可导致多种形式的DNA损伤，如碱基变化、脱氧核糖变化、DNA链断裂和交联(DNA链交联和DNA-蛋白交联)。而DNA链断裂是辐射损伤的主要形式，其中DNA单链断裂与辐射剂量呈线性关系，但DNA双链断裂可高于射线的直接电离作用；而且射线还可干预碱基损伤以及单链DNA断裂之后的损伤修复过程，如果是双链DNA断裂，则可导致细胞致死性的损伤。

本研究结果显示，经RT-PCR法检测发现，IMRT作用后的左侧股骨棘球蚴包囊细胞凋亡相关基因Caspase-3大量表达，但未接受IMRT治疗的右侧股骨棘球蚴病区棘球蚴包囊细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达极少量。凋亡蛋白酶的激活是凋亡发生机制中最关键的环节之一，Caspase家族活化对放射后骨棘球蚴细胞的凋亡起着至关重要的作用。Caspase家族本质上是天冬氨酸蛋白酶，因此在正常的细胞体内都以无活性的酶原状态存在。但是当细胞受损伤而产生凋亡时，首先表现为Caspase 活化，其余的 Caspase依次关联为级联反应，从而产生、促进细胞凋亡。Caspase的成员有很多，其中与凋亡的关系最为密切的因子是Caspase-3，其作用于凋亡的中期，而且其在细胞凋亡效应阶段起核心作用。

本研究针对大鼠股骨骨棘球蚴区域给予40 Gy剂量的IMRT治疗，从照射后棘球蚴包囊细胞的形态结构改变、凋亡因子的表达均提示：IMRT对新疆大鼠继发性骨棘球蚴有很好的杀灭作用。提示通过IMRT合理的放疗方案的实施，临床可达到对骨棘球蚴的创伤小、疗程短、根治性的治疗。本研究初步证实IMRT可以直接导致新疆大鼠继发性骨棘球蚴包囊细胞的凋亡，可以通过激活Caspase-3诱导生发细胞凋亡，但是IMRT如何让激活 Caspase-3诱导细胞凋亡的上游事件还不清楚，有待进一步探索。

参考文献:

[1] 史大中. 中国囊性包虫病的地理分布[J]. 地方病通报, 2000, 15(1):74-75.

[2] 谢增如，刘大鹏，温浩，等. 骨细粒棘球蝴病动物模型的建立[J]. 中国寄生虫病防治杂志, 2005, 18(2):127-128.

[3] 徐万龙，缪晓刚，塔依尔江·举来提，等. 三维适形调强放疗对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的影响[J]. 中国实用医刊, 2012, 39(18):41-43.

[4] Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme[J]. Cell, 1993, 75(4):641-652.

[5] 徐万龙，瓦热斯江·尼牙孜，塔依尔江·举来提，等. 三维适形调强放疗联合口服阿苯哒唑对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的治疗作用[J]. 医学动物防制, 2012, 28(11):1181-1183.

[6] Xu WL, Xilinbaoleri, Liu H, et al. Spinal cord biological safety of image-guided radiation therapy versus conventional radiation therapy[J]. Neural Regenerat Res, 2012, 7(35):2755-2760.