间充质干细胞与细粒棘球绦虫原头节共培养对细粒棘球绦虫原头节活性的影响

邹海亮，桂显伟，陈贺捷，陈 帅，吴向未

（石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008）

细粒棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）又叫囊性包虫病、肝包虫病，是指由细粒棘球绦虫的中绦期幼虫感染引发的一种人畜共患病[1-3]。此病不仅见于人类，也可在绵羊、猪、山羊、骆驼、水牛和马等动物中发病。目前，临床上治疗CE 的方式首选外科手术，常用的手术方式有肝包虫内囊摘除术、肝包虫内囊摘除+ 外囊部分摘除术及肝部分切除术[4]。对此病患者进行手术治疗存在一定的风险，且术后其病情有复发的可能。对此病患者进行药物治疗虽然可取得一定的效果，但易对其造成肝损伤[5]。有研究指出，在CE 发病的过程中，由成纤维细胞引起的钙盐沉积及成骨作用在促进包虫外囊壁的形成中起着重要作用[6]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是来源于动物体内中胚层的一种多能干细胞，具有免疫调节、抗炎、营养细胞等多种作用，其具有自我更新与增殖能力，在适宜的微环境中具有向血管、脂肪、神经、软骨、骨骼等多个胚层组织和细胞内分化的潜能。在机体发生损伤或受到刺激时，体内所储存的MSC 就会向损伤部位聚集，定向迁移至损伤部位并进行分化，替代损伤的细胞，以维持机体的完整性和稳定性[7]。在CE 发展的过程中，MSC 由于归巢作用会在患者体内肝脏的受损处与细粒棘球绦虫或其头节产生相互作用，进而可对此病的发展起到促进作用[8]。本文主要是研究将MSC 与细粒棘球绦虫原头节共培养对细粒棘球绦虫原头节活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验原材料

纯合子C5/7 小鼠，购买于新疆医科大学动物实验中心。自然感染CE 的绵羊，购买于新疆昌吉屠宰场。

1.2 化学试剂

磷酸缓冲溶液（PBS），胎牛血清和RPMI DMEM 培养基（均购自美国 Gibco-BRL 公司），Caspase-3 检测试剂盒（购自北京普利莱基因技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 细粒棘球绦虫原头节的体外提取及培养方法 将感染CE 绵羊的肝脏取出，对肝脏进行清洗。准备好提取细粒棘球绦虫原头节所需的器械和工具，包括无菌注射器、手术刀片及刀柄、组织镊2 ～3 个、200 ml 的无菌玻璃瓶。用注射器刺入绵羊肝脏中的包虫囊泡内，提取囊液与头节的混悬液，将其置于无菌的玻璃瓶中。用PBS 对玻璃瓶中的液体进行反复冲洗，弃去上清液，重复此操作15 次以上。将提纯的细粒棘球绦虫原头节置于加有5 ml DMEM 培养液（内含10% 的FBS 和1% 的双抗）的培养瓶中，放入无菌恒温培养箱（温度为37.5℃，内含浓度为5% 的二氧化）中培养2 d。2 d 后，采用伊- 红染色法在倒置显微镜下观察细粒棘球绦虫原头节的活性，若其存活率≥95%，则可用于下一步试验。

1.3.2 MSC 的提取方法 选取3 ～4 周龄的C5/7 小鼠，用颈椎脱臼法将其处死，然后将其放入浓度为75% 的酒精中浸泡10 min。10 min 后取出小鼠，用眼科小器械（小齿镊、小剪刀）分离出小鼠下肢的长骨干。用小剪刀剪除长骨干两侧的干垢端，用1 ml 的注射器抽取2.5 ml 的DMEM培养液（内含10% 的FBS 和1% 的双抗）反复冲洗骨髓腔2 次，直至骨髓腔变白。将冲洗后的液体取出并放入一个6 cm 的培养皿中。将培养皿放置在无菌恒温培养箱（温度为37.5℃，内含浓度为5% 的二氧化碳）中进行培养。20 ～24 h 后第一次换液，之后每隔48 h 换液一次。在细胞增殖至占整个培养皿底90% 以上后对其进行细胞传代，重复以上步骤得到p3 代MSC，用于后续试验。

1.3.3 将细粒棘球绦虫原头节与MSC 体外共培养的方法 取2 份等量的细粒棘球绦虫原头节，将其分别作为A 组与B 组。将A 组细粒棘球绦虫原头节与培养好的p3 代MSC 放入6 cm的培养皿中进行共培养，对B 组细粒棘球绦虫原头节进行单独普通培养。以培养当天、培养的第2 天、第4 天、第6天、第8 天和第10 天作为观察时间节点，取两组细粒棘球绦虫原头节中等量的细粒棘球绦虫原头节（约100 个），对其进行伊- 红染色，然后在光学倒置显微镜下观察其活性及存活情况。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0 软件处理本研究中的数据，计数资料用%表示，用χ²检验，计量资料用均数±标准差（±s）表示，用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSC 的培养、细粒棘球绦虫原头节的提取及二者的共培养

原代的MSC 从小鼠骨髓中提取出后，24 h 内换液去除其中的部分杂质，干细胞的增殖能力强，约48 h 可将6 cm的培养皿基本铺满。将MSC 传代至第p3 代MSC，可祛除培养皿内的杂质，获得更纯净的MSC。在显微镜下进行观察可见，MSC 呈梭型或纺锤型、成簇样排列（详见图A）。细粒棘球绦虫原头节在静止时呈圆形或类圆形，在活动时呈长条状（详见图B），在显微镜下能观察到虫体的蠕动。用伊- 红染料对新提取的细粒棘球绦虫原头节进行浸润后，其拒染率约为99%，表示虫体的活性良好。将细粒棘球绦虫原头节放入MSC 培养基中进行共培养的情况详见图C。

2.2 培养期间两组细粒棘球绦虫原头节抗染的情况及光镜下的形态

在培养期间，采用伊- 红染色法在倒置显微镜下抽样观察两组细粒棘球绦虫原头节的活性，结果显示，活性较好的细粒棘球绦虫原头节呈拒染状态（如图D 中绿色箭头所指的头节），活性差或活性较差的细粒棘球绦虫原头节可发生头部深染或全身深染（如图中蓝色箭头所指的头节）。在染色的情况下，活性较好的细粒棘球绦虫原头节可依旧保持其头节原有的形态（呈圆形或类圆形），活性差或活性较差的细粒棘球绦虫原头节呈口器逐渐外翻的状态，虫体膨大，其末端胚泡膨大或脱落（详见图D）。

2.3 培养期间两组细粒棘球绦虫原头节的存活率

在培养期间，采用伊- 红染色法在倒置显微镜下抽样观察两组细粒棘球绦虫原头节的存活情况，结果显示，B组细粒棘球绦虫原头节随着时间的推移其存活率逐渐下降。在培养的第8 天和第10 天，B 组细粒棘球绦虫原头节的存活率均低于A 组细粒棘球绦虫原头节，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 培养期间两组细粒棘球绦虫原头节的存活率[n（%）]

3 讨论

CE 是一种人畜共患病。细粒棘球绦虫主要寄生于人类及牲畜等中间宿主的肝、肺、脑等器官中，可发育成包囊，对人畜的脏器功能损伤严重。农牧民在感染细粒棘球绦虫后的半年内虫包囊的直径可达到0.5 ～1.0 cm，而其常因各种原因而不能及时就诊，导致其体内的虫包囊每年以1 ～5 cm（直径）的速度增长，最大直径可达数十厘米。有报道称，细粒棘球绦虫外增性的生长方式及致病机理与其纤维外包膜的存在密切相关[9]。细粒棘球绦虫纤维包膜的形成机制与成纤维细胞的钙化机理密切相关。有报道称，成纤维细胞可像成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内钙盐沉积，这一机制可能在细粒棘球绦虫周围纤维囊壁钙化的形成中起到重要作用[10]。对CE 患者进行手术治疗成功与否取决于其体内细粒棘球绦虫包囊的完整性及术中是否出现囊液外溢的情况。细粒棘球绦虫包囊的外囊壁完整可为手术切除的范围提供依据，且有助于降低患者术后并发症的发生率[11]。

MSC 具有多种分化潜能，能分泌多种细胞因子，具有调节细胞的增殖、营养、凋亡、支持、存活、迁移、归巢、分化和表型等多种细胞反应的作用[12-13]。在CE 发展的过程中，MSC 由于归巢作用会在患者体内肝脏的受损处与细粒棘球绦虫或其头节产生相互作用，进而可对此病的发展起到促进作用。CE 在人体内致病的过程中，MSC 与细粒棘球绦虫头节及细胞均有密切接触，且二者可相互影响，互相反馈与调节。本研究的结果显示，在培养期间，B 组细粒棘球绦虫原头节随着时间的推移其存活率逐渐下降。在培养的第8 天和第10 天，B 组细粒棘球绦虫原头节的存活率均低于A 组细粒棘球绦虫原头节，差异有统计学意义（P＜0.05）。究其原因可能是，将MSC 与细粒棘球绦虫原头节共培养后二者会产生相互刺激，促进活性因子的分泌，对细粒棘球绦虫原头节的活性产生影响，但其具体影响机制仍有待进一步研究明确。

综上所述，将MSC 与细粒棘球绦虫原头节共培养，对细粒棘球绦虫原头节的活性具有促进作用。本研究可能为CE 的治疗提供一种新的思路。