IMRT对鼠继发性骨棘球蚴杀灭效果及周围神经损伤的实验研究

徐万龙， 徐江波， 孙俊刚， 周文正， 赵喜滨， 王 浩， 袁 宏

(新疆维吾尔自治区人民医院骨一科， 乌鲁木齐 830001)

棘球蚴病又称包虫病，是由棘球绦虫的幼虫寄生在人畜之间相互传染的寄生虫病，严重危害全球人类的健康[1]。当棘球绦虫的幼虫寄生于骨组织，即可发生骨棘球蚴病。针对骨包虫病，现有的药物、手术等治疗手段疗效差，复发率及致残率高。近些年，三维适形调强放疗(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)因其良好的肿瘤杀灭率、周围器官保护性等临床优势，已成为临床肿瘤治疗最重要的手段之一。根据IMRT对肿瘤细胞有很好的杀灭效果及对周围器官良好的安全保护作用，部分学者认为IMRT对骨棘球蚴细胞也应该有很好的杀灭作用，而且对周围组织很好的生物安全性[2-4]。本研究通过模拟临床对棘球蚴病区实施IMRT，观察IMRT对鼠继发性骨棘球蚴的杀灭效果及周围神经的损伤，以期探讨IMRT对骨棘球蚴病的治疗有效性及安全性。

1 材料与方法

1.1实验动物的选取及放射治疗选用中国武警总医院实验动物实验室提供的双侧股骨继发性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。将骨包虫大鼠先行X线及CT检查，均提示股骨继发性棘球蚴接种成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯卧位摆置于自制的放疗体膜内并稳定固定。采用飞利浦Mx8000多层螺旋CT扫描机对左侧股骨棘球蚴病区进行扫描，扫描密度为1 mm/层，将收集的数据上传到Somavison系统内，进行信息重建，并将周围的血管、肌腱、神经、皮肤勾画为需要保护的器官。勾画完放疗区域后，利用三维适形调强放疗仪的计算机计算系统对骨包虫区域的放射剂量及剂量分布均匀程度按照放疗计划进行分析和计算。经专业放射物理师对50只鼠股骨棘球蚴病区给予40 Gy剂量的IMRT治疗。

1.2取材将经IMRT放射治疗后的棘球蚴病鼠吸入麻醉处理后，空气栓塞活杀处死，在显微镜下取出股骨骨髓腔内的棘球蚴的包囊，经甲醛、戊二醛浸泡保存以及液氮低温保存。

1.3Westernblot法定量检测骨棘球蚴包囊中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达使用RIPA裂解细胞抽提总蛋白, BCA法蛋白定量。将样本转膜到PVDF膜上，脱脂牛奶后进行封闭, 添加一抗(β-actin, 1∶2 000；Caspase-3, 1∶200) ，室温过夜。冲洗后加入二抗，室温保存冲洗后, ECL显影。采用Western blot法定量检测骨棘球蚴包囊中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。

1.4光镜、电镜检测坐骨神经神经元细胞形态将经甲醛固定的标本，石蜡包埋后行4 μm切片，常规HE染色，光镜下观察坐骨神经神经元的组织学改变。将经戊二醛、锇酸处理后的坐骨神经组织再次进行浸泡，用缓冲液进行反复冲洗，然后采用阶梯浓度的医学酒精进行反复脱水处理，再次用缓冲液进行反复冲洗后将其浸泡于丙酮中低温保存。采用环氧树脂、固化剂等进行浸泡后包埋并烘干，将组织块进行休整并切片后铺于金属铜网表面。依次进行枸橼酸铅、醋酸铀染色。在光镜、电镜下观察接受放疗后坐骨神经神经元细胞的形态学。

2 结果

2.1Westernblot法定量检测骨棘球蚴包囊中凋亡相关蛋白Caspase-3表达的结果Western blot法检测到大鼠股骨棘球蚴包囊的细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3大量表达，见图 1。

图1 Western blott检测Caspase-3蛋白表达图

2.2光镜、电镜检测坐骨神经神经元细胞形态结果HE染色显示接受IMRT放疗后骨棘球蚴鼠的坐骨神经神经元细胞形态基本正常，少量神经元细胞为可逆性变化，神经元细胞形态为三角形或多边形，树突轴突清晰可见，细胞核形态饱满，结构均正常，尼氏小体数量丰富，于胞浆内分布均匀(图2)。透射电镜检测结果显示，接受IMRT放疗后骨棘球蚴鼠的坐骨神经神经元细胞正常形态，细胞膜未出现破裂，胞质内细胞器形态完整，细胞核居中，无固缩(图3)。

图2 IMRT放疗后骨棘球蚴鼠的坐骨神经神经元(HE×400)

3 讨论

放射治疗是治疗恶性肿瘤最重要的手段之一，21世纪以来，随着影像学技术、计算机技术的快速进展，放射治疗已进入了精确放疗的时代，其中三维适形调强放疗(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)已成为最具代表性的放疗技术。IMRT是通过计算机控制射线的方向，将精确的、剂量高的射线集中在医者所关心的病变组织区域，而周围组织很少受到射线的损伤，所以IMRT是现有临床上一种可靠的、精度高的放射治疗方法，受到学者的推崇[2-4]。

图3 IMRT放疗后骨棘球蚴鼠的坐骨神经神经元(电镜 8 000倍)

本研究结果提示IMRT作用1 w后，Western blot法检测到鼠股骨棘球蚴包囊的细胞中凋亡相关基因Caspase-3大量表达，说明在IMRT的作用下鼠股骨棘球蚴包囊的细胞产生了不可逆性的凋亡，说明IMRT对大鼠继发性骨棘球蚴病有很好的杀灭作用及其有效性。坐骨神经是下肢放疗最重要的、需要保护的器官，而光镜、电镜检测结果提示鼠股骨棘球蚴包囊周围的坐骨神经神经元细胞形态结构正常，未受到放射线损伤，提示IMRT在治疗骨棘球蚴病方面具有很高的周围组织安全性。

本研究结果提示IMRT对鼠继发性骨棘球蚴病有很好的治疗效果，而且有很高的安全性。考虑其原因：IMRT通过对鼠继发性骨棘球蚴病靶区的精确定位、精确计划、精确照射可以使靶区接受最大的治疗放射线，而周围组织承受的剂量大大降低，从而减少了周围重要器官发生放射损伤的几率。所以本实验中并未发生普通放疗治疗骨棘球蚴病而出现的病鼠照射部位出现脱毛及皮肤溃疡[5]。本研究认为临床上将IMRT用于骨包虫的治疗，具有以下优点: (1)体外照射，不手术，无侵入性，创伤小；(2)不会造成囊液和囊内容物的泄漏，减少异位种植，减少因骨包虫囊壁破裂、溢漏引起的过敏性休克甚至死亡；(3)放射线可彻底清除深藏于松质骨、骨小梁中间的骨包虫头节，降低骨包虫残留率、复发率；(4)IMRT射线集中，局部高能杀灭骨包虫，周围组织损伤低，且减少长期服药对肝、肾的损伤；(5)住院期间即可完成治疗，避免患者出院后长期服药，增加患者依从性。

本实验初步证实IMRT对鼠继发性骨棘球蚴病有很好的治疗效果，而且有很高的安全性，但本研究只是初步的动物实验研究，要将此结果推广、应用于临床，还需要通过大宗的临床研究进行验证。

参考文献:

[1] Wang K, Zhang X, Jin Z, et al. Modeling and analysis of the transmission of Echinococcosis with application to Xinjiang Uygur Autonomous Region of China[J]. J Theor Biol, 2013, 333(10): 78-90.

[2] 徐万龙，瓦热斯江·尼牙孜，塔依尔江·举来提，等. 三维适形调强放疗联合口服阿苯哒唑对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的治疗作用[J]. 医学动物防制, 2012, 28(11): 1181-1183.

[3] 徐万龙，缪晓刚，塔依尔江·举来提，等. 三维适形调强放疗对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的影响[J]. 中国实用医刊, 2012, 39(18): 41-43.

[4] Xu WL, Xilinbaoleri, Liu H, et al. Spinal cord biological safety of image-guided radiation therapy versus conventional radiation therapy[J]. Neural Regenerat Res, 2012, 7(35): 2755-2760.

[5] 谢增如，李振环. 骨细粒棘球蚴病动物模型的放疗效果[J]. 中国实验外科杂志, 2009, 26(12): 1768.