钙敏感受体及紧密连接蛋白-14在草酸钙结石大鼠肾组织中的表达及意义

2014-07-05 16:38孙稳王勤章丁国富
天津医药 2014年7期
关键词:草酸钙肾小管肾结石

孙稳王勤章丁国富

钙敏感受体及紧密连接蛋白-14在草酸钙结石大鼠肾组织中的表达及意义

孙稳1王勤章2△丁国富2

目的初步探讨钙敏感受体(CaSR)和紧密连接蛋白(Claudin)-14在肾草酸钙结石大鼠肾组织中的表达及意义。方法30只雄性SD大鼠随机分为对照组和结石组各15只,采用1%乙二醇和2%氯化铵每日2 mL灌胃诱导制作大鼠肾草酸钙结石模型。免疫组织化学检测CaSR蛋白表达;RT-PCR检测Claudin-14 mRNA表达;Western-Blotting分别检测CaSR和Claudin-14蛋白表达;全自动生化分析仪检测2组大鼠肾功能、血及尿生化指标。结果光镜下结石组有大量结石结晶形成,血清肌肝(Cr)、尿素氮(BUN)、24 h尿钙及尿量较对照组升高(P<0.01),2组间血钙、尿pH差异无统计学意义。结石组Claudin-14 mRNA及CaSR蛋白表达较对照组升高(P<0.01),Claudin-14蛋白在结石组大鼠肾组织中呈特异性高表达,对照组未检测到Claudin-14蛋白表达;结石组大鼠肾组织中CaSR 和Claudin-14蛋白表达呈正相关,同时,CaSR、Claudin-14蛋白表达与24 h尿钙排泄量也呈正相关。结论CaSR和Claudin-14表达增高可通过增加尿钙排泄量,进而参与结石的形成。

肾结石;草酸钙;受体,钙敏感;大鼠,Sprague-Dawley;紧密连接蛋白-14

泌尿系结石的形成是由多因素共同作用所致,其病理机制目前尚不明确。研究表明:尿钙排泄增高是诱发或促进含钙尿路结石形成的一个重要危险因素[1]。钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)是近年来发现的与尿钙排泄显著相关的G蛋白偶联受体,其可通过上调髓袢升支粗段(thick ascendinglimb,TAL)紧密连接蛋白-14(Claudin-14)的表达抑制肾小管对钙离子的重吸收[2],从而增加尿钙排泄。因此,笔者推测CaSR和Claudin-14可能在泌尿系含钙肾结石形成过程中发挥重要生理学作用。本研究通过构建大鼠肾草酸钙结石模型来初步探讨CaSR 和Claudin-14在结石大鼠肾组织中的表达变化及其与尿钙排泄的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料(1)实验动物。8周龄SD雄性大鼠30只购于新疆医科大学动物实验中心,SPF级,体质量(200±20)g。(2)主要试剂和仪器。乙二醇、氯化铵(Sigma,美国),小鼠抗CaSR抗体(Abcom,美国),兔抗Claudin-14抗体(Santa Cruz,美国),山羊抗小鼠二抗lgG、山羊抗兔二抗lgG、PV6000通用型Polymer Kit试剂盒(北京中杉金桥),Trizol Reagent(Invitrogen公司,美国),逆转录试剂盒(Fermentas公司,美国),PCR引物(上海生工生物工程公司),蛋白裂解液提取试剂盒RIPA(北京索莱宝科技有限公司),彩虹Marker(Termo Scientific公司,美国),Au1000自动生化分析仪(Olympus,日本),180-80型原子吸收分光光度计(Hitachi Limited,日本),PCR仪(TaKaRa,日本),mini垂直电泳槽,半干式转印系统(Bio-rad公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和大鼠肾结石模型的构建参照曹正国等[3]的方法制作大鼠肾结石模型。30只SD大鼠按随机数字表法分为2组,各15只。对照组:自来水饮水,每日每只2 mL生理盐水灌胃;结石组:含1%乙二醇自来水自由饮水,每日每只2 mL 2%氯化铵灌胃。大鼠适应性饲养3天,连续灌胃4周。

1.2.2 血、尿生化检测实验第28天收集实验大鼠24 h尿液,进行24 h尿钙含量测定。水合氯醛麻醉下腔静脉穿刺取血4 mL,3 000 r/min 4℃离心10 min,取上清,检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+水平。

1.2.3 肾组织HE染色及CaSR免疫组织化学检测连续灌胃4周后水合氯醛麻醉处死实验大鼠,手术切取左肾,福尔马林溶液固定,石蜡包埋后切片行常规HE染色,普通光学显微镜下观察肾组织形态学变化及肾小管区有无结石结晶,以判断肾结石模型是否成功建立。另取肾组织切片,分步行脱蜡,抗原修复,血清封闭,滴加CaSR抗体(1∶750),4℃孵育过夜,DAB显色,复染,透明,封片等,观察CaSR免疫组织化学染色情况。

1.2.4RT-PCR法检测肾脏组织Claudin-14mRNA表达Trizol法提取肾组织总RNA。紫外分光光度计测定提取的RNA A260/A280均在1.8~2.0之间,用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA纯度。将RNA反转录为cDNA后进行Claudin-14 和GAPDH基因的PCR检测。Claudin-14引物:上游5′-GACGAGGTGACTTCTCTGGC-3′,下游5′-ACACACCCTCTAGTGCAGGC-3′,产物大小242 bp。反应条件为:95℃5 min,95℃30 s,58℃30 s,72℃45 s,35个循环,72℃10 min;GAPDH引物:上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′,下游5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,产物大小496 bp。反应条件为:95℃5 min,95℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,35个循环,72℃10 min,取4 μL PCR产物加1 μL的溴芬蓝进行琼脂糖凝胶电泳观察,并用Bio-rad凝胶成像分析系统分别计算Claudin-14、GAPDH mRNA的积分光密度值。

1.2.5Western-Blotting法检测肾脏组织CaSR和Claudin-14表达取100 mg肾脏组织低温研磨后,加入PMSF及蛋白裂解液(1∶100),冰上放置40 min,4℃下13 300 r/min离心40 min后取上清。以BSA为标准,用Bradford法对上清进行蛋白定量。取40 μg蛋白样品,10%SDS-PAGE电泳,半干转至硝酸纤维素膜,37℃封闭液中封闭2 h;分别使用CaSR抗体(1∶500)和Claudin-14抗体(1∶500),4℃下孵育12 h。次日用TBST洗膜3次,每次20 min,加入相应的二抗(1∶20 000),室温下孵育2 h,TBST洗膜3次,每次20 min,ECL化学发光试剂显色,显影定影处理,Quantity one软件分析图像。以β-actin蛋白条带为内参照,结果用靶蛋白/β-actin表示。采用TBS-T液代替CaSR抗体或Claudin-14抗体孵育作为阴性对照。

1.3 统计学方法采用Sigmstat 3.5统计软件进行分析,计量数据均用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,相关分析采用Pearson相关,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血、尿生化检测结果结石组血BUN、血Cr、尿量、24 h尿钙排泄量高于对照组(P<0.01),2组血钙值均在正常范围内,差异无统计学意义。2组间24 h 尿pH差异亦无统计学意义,见表1。

Tab.1 The biochemical indices in blood and urine in two groups表1 对照组和结石组大鼠血、尿液生化指标(n=15,±s)

Tab.1 The biochemical indices in blood and urine in two groups表1 对照组和结石组大鼠血、尿液生化指标(n=15,±s)

**P<0.01

组别对照组结石组t 血BUN (mmol/L) 8.27±0.20 17.09±1.42 6.096**血Cr (μmol/L) 40.05±1.54 72.95±3.99 7.689**血钙(mmol/L) 2.57±004 2.70±0.05 1.919组别对照组结石组t 尿pH 6.49±0.03 6.39±0.05 0.153 24 h尿量(mL) 13.20±0.55 21.27±1.08 6.646**24 h尿钙(mmol) 3.26±0.60 9.66±1.10 5.111**

2.2 形态学观察肉眼可见结石组肾组织肿胀,表面点状分布黄白色结晶或钙化,见图1。HE染色可见结石组肾组织多数肾小管管腔内弥漫散布无色透明、片状结晶,皮质多于髓质,主要位于近曲小管和远曲小管。肾小管上皮细胞明显肿胀、变性、坏死,管腔内可见嗜伊红样坏死物质及部分脱落上皮细胞,肾间质有炎性细胞侵润,对照组无上述病理改变,见图2。

Fig.1 Changes in appearance of rat kidney in two groups图1 大鼠肾脏外观变化

Fig.2 HE staining of rat kidney tissues in two groups图2 大鼠肾组织HE染色(×200)

2.3 肾组织CaSR免疫组织化学结果2组肾小管上皮细胞均有不同程度的CaSR阳性表达,主要定位于细胞膜,呈棕褐色。结石组肾小管上皮细胞CaSR呈弥漫性表达且强度明显高于对照组,见图3。

Fig.3 The positive expression of CaSR in rat kidney tissues图3 大鼠肾组织CaSR阳性表达(免疫组化×200)

2.4 肾组织Claudin-14 mRNA检测结果结石组Claudin-14 mRNA高于对照组,差异有统计学意义(0.128±0.006 vs 0.039±0.007,t=13.899,P<0.01),见图4。

Fig.4 Changes of Claudin-14 mRNA/GAPDH expression in rat kidney tissues图4 大鼠肾组织Claudin-14 mRNA/GAPDH表达变化

2.5 肾组织CaSR和Claudin-14 Western-Blotting结果结石组CaSR蛋白表达水平高于对照组(6.697± 0.051 vs 5.016±0.053,t=88.350,P<0.05),Claudin-14蛋白表达水平亦高于对照组(1.520±0.010 vs 0,t= 198.00,P<0.01),见图5、6。结石组大鼠肾组织中CaSR和Claudin-14蛋白表达存在显著正相关(r= 0.896,P<0.01),因Claudin-14蛋白在对照组未见表达,故对照组未做相关性分析。

Fig.5 Expressions of CaSR/β-actin in rat kidney tissues detected by Western blot assay图5 大鼠肾组织CaSR蛋白Western-Blotting检测结果

Fig.6 Expressions of Claudin-14/β-actin in rat kidney tissues detected by Western blot assay图6 2组大鼠肾组织Claudin-14蛋白Western-Blotting检测结果

2.6CaSR和Claudin-14蛋白表达与24 h尿钙排泄的相关性结石组大鼠肾组织中CaSR和Claudin-14蛋白表达与24 h尿钙均呈正相关(r分别为0.878、0.934,均P<0.01)。

3 讨论

CaSR是G蛋白偶连血浆细胞膜受体家族中的一员[4],近年来Loupy等[5]发现在TAL上有CaSR存在,且激活后可抑制TAL内钙的重吸收,从而证实CaSR可调节肾小管对钙的重吸收。Claudin-14为紧密连接蛋白家族的一员,严格定位于肾脏的TAL[6],可通过调节细胞旁途径的紧密连接蛋白-16和紧密连接蛋白-19构成的阳离子通道渗透性调节肾小管对钙的重吸收[7-9]。Dimke等[2]通过激活小鼠肾组织中CaSR后,发现Claudin-14蛋白表达显著增高,且尿钙排泄也相应增加,证实CaSR在TAL主要是通过调节下游的Claudin-14蛋白表达来抑制钙的重吸收,同时,肾脏TAL的Claudin-14表达主要受此处CaSR调控。尿液中游离钙增高被认为是泌尿系含钙结石形成的主要危险因素[10],但结石大鼠肾组织中CaSR和Claudin-14表达变化如何,以及是否会增加尿钙排泄目前尚不明确。

本研究显示模型组大鼠肾小管中存在大量结石结晶,且尿钙明显高于对照组。免疫组织化学染色及Western-Blotting均证实肾结石大鼠肾组织中CaSR及Claudin-14蛋白表达均高于对照组,两者间存在正相关。Western-Blotting检测可见肾脏中表达的CaSR呈现出分子质量分别为130 ku和55 ku的两条带,其中130 ku是成熟形式,其C末端由复杂的碳水化合物糖基化,而55 ku是非成熟形式,为非糖基化形式。目前认为,只有其成熟形式作为受体存在于细胞膜上发挥生理学作用,但只占CaSR的一小部分,本文检测到的55 ku条带密度明显高于130 ku,与国内外文献一致[11]。同时,CaSR和Claudin-14蛋白表达与尿钙排泄水平也存在正相关。此外,本研究还证实在肾结石大鼠肾组织中Claudin-14蛋白特异性高表达,而在正常组无表达。由此推测:在模型组肾组织中CaSR和Claudin-14高表达可能参与了肾结石的形成,其机制可能是CaSR激活肾组织中Claudin-14表达,进而通过影响TAL上皮细胞膜上离子通道的渗透性,抑制尿中钙离子的重吸收,促进尿钙排泄[2],增加肾小管中结石结晶的形成的风险,但具体调节机制有待深入研究。

Gong等[12]研究发现Claudin-14基因在正常肾脏中不表达,通常在饮水过少或摄入钙过多时表达,通过分析肾脏中微小的非编码RNA,发现在CaSR下游有一个microRNAs(miR-9,miR-374)基础信号通路,它直接管控Claudin-14的表达及建立Claudin-14分子机制作为关键调节器来保持肾脏钙离子平衡。本研究也发现:Claudin-14 mRNA在对照组和结石组肾组织均有表达,且结石组表达水平显著高于对照组,而Claudin-14蛋白在结石组显著增高,在对照组不表达,推测Claudin-14蛋白在结石肾组织中表达变化有可能是由于体内结石形成因素上调CaSR后,通过调控microRNAs信号通路激活Claudin-14的基因转录、翻译,进而促进小管上皮细胞合成Claudin-14蛋白[13]。

综上,在高钙尿性肾结石形成过程中可能存在一个CaSR-Claudin-14调控通路,其可通过促进尿钙排泄参与泌尿系含钙结石的形成,其中CaSR可能是通过激活Claudin-14的基因转录、翻译发挥作用。

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(2013-11-04收稿2014-03-17修回)

(本文编辑李国琪)

Expressions of CaSR and Claudin-14 in Renal Calcium Oxalate Stone Model of Rats

SUN Wen1,WANG Qinzhang2,DING Guofu2
1Medical College of Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2 Department of Urology,The First Affiliated Hospital of Medical College in Shihezi University
WANG Qinzhang,E-mail:wqz1969@sina.com.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of calcium sensitive receptor(CaSR)and tight junction protein (Claudin)-14 in renal calcium oxalate stone rat model.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control group(n=15)and model group(n=15).The rat model of renal calcium oxalate stone was established by gavaging 1%glycol(2 mL/d)and 2%ammonium chloride.The expression of CaSR protein was detected using immunohistochemical assay.RTPCR was used to detect the Claudin-14 mRNA expression.The expression levels of CaSR and Claudin-14 protein were detected by Western blot assay respectively.The full automatic biochemical analyzer was used to detect rat renal function and changes of blood and urine biochemical indices.ResultsA large stone crystallization was observed under light microscope in model group.The serum levels of Cr,BUN,24-h urine calcium and urine volume were significantly higher in model group than those of control group(P<0.01).There were no significant differences in serum calcium level and urinary pH value between two groups.The expression levels of Claudin-14 mRNA and CaSR protein were significantly higher in model group than those of control group(P<0.01).The Claudin-14 protein expression was specifically higher in renal tissues of model group.There was no Claudin-14 protein expression in control group.There was a positive correlation between CaSR and Claudin-14 protein expression in renal tissues of model group.Also,CaSR and Claudin-14 protein expressions were positively correlated with the 24-h urine volume.ConclusionThe increased expressions of CaSR and Claudin-14 involved in the formation of kidney stone by increasing the urinary calcium excretion.

kidney calculi;calcium oxalate;receptors,calcium-sensing;rats,Sprague-Dawley;Claudin-14

R692.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.009

国家科技支撑计划项目(2013BAI05B05)

1石河子大学医学院(邮编832000);2石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科

△通讯作者E-mail:wqz1969@sina.com.cn

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