N-乙酰半胱氨酸对COPD大鼠模型血管活性物质的影响

唐汉庆，劳传君，李晓华，朱晓莹，李克明

（右江民族医学院，广西百色533000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的发生发展与机体氧化-抗氧化失衡有关。已有临床文献报道，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）可以改善肺功能，减少病情加重次数，缩短加重期病程，延缓疾病的进展速度，因此，NAC在COPD 抗氧化治疗中具有重要作用［1-2］。NAC 含有促进还原型谷胱甘肽（GSH）生物合成的半胱氨酸，是一种抗氧化剂，对体内氧自由基具有显著的拮抗作用。本研究建立COPD 大鼠模型，以NAC为干预药物，观察与氧化-抗氧化系统密切相关的血管活性物质丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、活性氧（ROS）、内皮素（ET）、一氧化氮（NO）及肺组织核转录因子κB（NF-κB）的变化，从NAC 抗氧化作用角度探讨其对COPD 治疗的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级Wistar大鼠100只，雌雄各半，体重280g～320g，本院科学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（桂）2012-0002。

1.1.2 药物与试剂NAC批号P120326，为美国Sigma公司产品；AngⅡ试剂盒批号201311，NO 试剂盒批号201306，ET试剂盒批号230611，NF-κB试剂盒批号120674，ROS试剂盒批号031045，均为南京建成生物工程研究所产品；MDA试剂盒批号20132501，为东亚免疫技术研究所产品；SOD 试剂盒批号012302，为深圳晶美生物工程公司产品。

1.1.3 主要仪器电子天平，AE160型，为瑞士Mettler公司产品；酶标仪，AD340型，为美国Beckman Coulter公司产品；生物显微镜，DMIL LED 型，为莱卡公司产品；分光光度计，722型，为上海精密科学仪器有限公司产品；γ放射免疫计数器，FJ-2021型，为广州飞迪公司产品；台式高速低温离心机，Z360K型，为德国HERMLE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和处理 适应性饲养7d后，随机分成对照组，模型组，NAC低、中、高剂量组共5组，每组20只。模型组造模方法：参考文献报道［3-4］，大鼠在室温环境下，第1、8、15、23 天大鼠麻醉后气管内滴脂多糖（LPS），将大鼠逐一称重，按50 mg／kg体重腹腔注射（ip）浓度为4g／L 戊巴比妥钠溶液，待大鼠麻醉后，将其固定于解剖台上，头低位暴露声门，将16 号静脉套管针沿气管走行快速插入气管，拔出针芯，接1 mL 注射器，1s内注入溶于注射用生理盐水的浓度为1mg／mL 的LPS 0.2mL（200 μg），将大鼠直立，左右旋转，使LPS在肺内均匀分布。第2天～第16 天给予大鼠每天2 次香烟烟熏，每次点燃烟丝的重量为9.03g（每支烟烟丝重量为0.645g），持续时间1h，间隔4h（滴LPS当天不烟熏）。被动吸烟方法：将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱（40cm×45cm×50cm）内，香烟点燃后，用60mL 注射器吸满烟雾，然后通过三通管将香烟烟雾快速注入染毒箱内（操作频率为20次／min），进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧产生的水蒸气对大鼠的影响，在箱底放置适量硅胶干燥剂。继续饲养90d，第91 天起，在模型组基础上，NAC低、中、高剂量组分别按26.32、52.64、105.28 mg／kg NAC灌胃（ig），连续2周。剂量计算参考文献［5］药动学研究中给药剂量标准进行折算，按单体折成平均临床等效剂量约52.64mg／kg。高剂量约为2倍于平均临床等效剂量（105.28mg／kg），中剂量为等量平均临床等效剂量（52.64 mg／kg），低剂量为1／2平均临床等效剂量（26.32mg／kg）。对照组、模型组大鼠每天给予2mL 生理盐水ig，相同室内环境下自由饮食饮水。

1.2.2 血管活性物质检测 取静脉血2mL，离心（4℃，1 000r／min，10min），分离血清，置-70℃冻存。采用硝酸还原酶法测定血清NO，采用比色法测定血清ROS，黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD；硫代巴比妥酸法测定MDA；取静脉血2 mL，加入30μL的100g／L EDTA Na2和40μL 抑肽酶，离心（4℃，4 000r／min，10 min）分离血浆，置-70℃冻存。采用放免法测定血浆ET；取静脉血5mL，加入冰浴的酶抑制剂30μL和0.3mmol EDTA Na2，离心（4℃，1 000r／min，5min），分离血浆，置-70℃冻存，采用放免法在冰浴中测定AngⅡ。均严格按说明书操作进行检测。

1.2.3 NF-κB 活性表达检测 取肺组织采用免疫组化SABC法测定，按试剂盒说明书进行操作，NF-κB 活性表达以NF-κB阳性细胞率表示，高倍光镜下随机观察10个视野，至少计数1 000个细胞，取其阳性细胞数平均值为该组的细胞阳性率。

1.2.4 统计学处理 数据统计采用SPSS 13.0软件。计量资料用均数±标准差（±SD）表示。组间比较用单因素方差分析及t检验。采用Spearman方法分析相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血管活性物质水平

与对照组比较，模型组AngⅡ、ROS、ET、MDA水平均极显著升高（P＜0.01），而NO、SOD 水平均极显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，低剂量组NO 水平升高、ET 水平显著下降（均P＜0.05）；中剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平显著下降或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01），而NO、SOD 水平均显著升高（均P＜0.05）；高剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均极显著下降（P＜0.01）而NO、SOD 水平均极显著升高（均P＜0.01）（表1）。

表1 各组血管活性物质水平比较Table 1 Comparison of the levels of vasoactive substances in each group

2.2 NF-κB活性表达检测

与对照组比较，模型组NF-κB阳性细胞率极显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组NF-κB阳性细胞率下降，但差异没有统计学意义（P＞0.05），中剂量组NF-κB 阳性细胞率显著下降（P＜0.05），高剂量组NF-κB 阳性细胞率极显著下降（P＜0.01）（图1）。

图1 各组NF-κB活性表达比较Fig.1 Comparison of NF-κB activities in each group

2.3 相关性分析

AngⅡ 水平与NF-κB 活性，AngⅡ 水平与ROS水平均呈显著正相关关系，r值分别为0.835和0.864（P＜0.01）。

3 讨论

COPD 发病机制的研究集中于气道炎症及感染、蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡、黏液分泌过多和小气道阻塞方面［6］，但近来的研究显示氧化应激损伤在COPD 发病机制中有重要影响［7］，各种类型的氧化剂通过损害血清蛋白酶抑制剂，加强弹性酶的活性和增加黏液的分泌参与COPD 的病理过程［8］，氧化剂还通过直接氧化，作用于花生四烯酸而产生异前列腺素，其对气道产生多种效应，包括支气管缩窄、血浆漏出增加和黏液过度分泌［9］。此外，氧化剂能活化转录NF-κB，NF-κB可协助转录其他许多炎症因子而加重COPD 病理改变［10］。

NF-κB 的活化过程可被抗氧化剂等抑制，抗氧化剂能对抗氧自由基的损伤，抑制ROS介导的激活NF-κB 的过程，此类抗氧化剂的代表如NAC。NAC是一种含-SH 的小分子化合物，易于进入细胞并在细饱内去乙酸化后生成L-半胱氨酸，提供合成细胞内重要的非酶类抗氧化物还原型谷胱甘肽（GSH）的底物，补充细胞内GSH 的含量，对抗ROS等氧化损伤。

由于氧化应激反应引起机体AngⅡ分泌水平升高，诱导ROS等的产生［11］，大量的ROS氧自由基使舒血管物质NO 失活，缩血管物质ET 大量产生，使对血管舒缩功能具有调节作用的NO／ET失衡，同时，由于炎症因子的损害作用，SOD 活性降低而MDA 活性表达上升［12］。氧化应激造成血管损伤、血浆漏出增加、加重炎症及感染，这些因素加重COPD 症状，使临床治疗COPD 耗时低效。在本试验中，观察到与对照组比较，模型组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均显著升高，表明氧化应激损伤引起COPD 病理变化，同时，模型组NF-κB 阳性细胞率显著升高，与对照组比较差异也有统计学意义，表明COPD 炎症加重，此外，相关性分析结果显示AngⅡ水平与NF-κB 活性以及AngⅡ水平与ROS水平均呈显著正相关，提示降低AngⅡ水平，从而减少ROS的产生，进而抑制NF-κB 活化过程是改善COPD 氧化损伤的一条途径。

采用NAC 干预后，观察到与模型组比较，低剂量组NO 水平显著升高、ET 水平显著下降；中剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平显著下降或极显著下降而NO、SOD 水平均显著升高；高剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均显著下降而NO、SOD 水平均极显著升高，说明NAC 能改善COPD 氧化损伤，但与剂量有关，低剂量效果不明显，以高剂量改善效果明显，提示临床上治疗COPD 可能需要较大的剂量。综合本试验结果，推测NAC 可能通过调节AngⅡ水平，抑制ROS 以及NF-κB 活化，提高SOD 等水平发挥抗氧化应激损伤作用的，也为新型抗氧化剂的开发提供了思路。

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