唐汉庆,劳传君,李晓华,朱晓莹,李克明
(右江民族医学院,广西百色533000)
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的发生发展与机体氧化-抗氧化失衡有关。已有临床文献报道,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以改善肺功能,减少病情加重次数,缩短加重期病程,延缓疾病的进展速度,因此,NAC在COPD 抗氧化治疗中具有重要作用[1-2]。NAC 含有促进还原型谷胱甘肽(GSH)生物合成的半胱氨酸,是一种抗氧化剂,对体内氧自由基具有显著的拮抗作用。本研究建立COPD 大鼠模型,以NAC为干预药物,观察与氧化-抗氧化系统密切相关的血管活性物质丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧(ROS)、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)及肺组织核转录因子κB(NF-κB)的变化,从NAC 抗氧化作用角度探讨其对COPD 治疗的影响。
1.1.1 动物 清洁级Wistar大鼠100只,雌雄各半,体重280g~320g,本院科学实验中心提供,动物合格证号:SCXK(桂)2012-0002。
1.1.2 药物与试剂NAC批号P120326,为美国Sigma公司产品;AngⅡ试剂盒批号201311,NO 试剂盒批号201306,ET试剂盒批号230611,NF-κB试剂盒批号120674,ROS试剂盒批号031045,均为南京建成生物工程研究所产品;MDA试剂盒批号20132501,为东亚免疫技术研究所产品;SOD 试剂盒批号012302,为深圳晶美生物工程公司产品。
1.1.3 主要仪器电子天平,AE160型,为瑞士Mettler公司产品;酶标仪,AD340型,为美国Beckman Coulter公司产品;生物显微镜,DMIL LED 型,为莱卡公司产品;分光光度计,722型,为上海精密科学仪器有限公司产品;γ放射免疫计数器,FJ-2021型,为广州飞迪公司产品;台式高速低温离心机,Z360K型,为德国HERMLE公司产品。
1.2.1 动物分组和处理 适应性饲养7d后,随机分成对照组,模型组,NAC低、中、高剂量组共5组,每组20只。模型组造模方法:参考文献报道[3-4],大鼠在室温环境下,第1、8、15、23 天大鼠麻醉后气管内滴脂多糖(LPS),将大鼠逐一称重,按50 mg/kg体重腹腔注射(ip)浓度为4g/L 戊巴比妥钠溶液,待大鼠麻醉后,将其固定于解剖台上,头低位暴露声门,将16 号静脉套管针沿气管走行快速插入气管,拔出针芯,接1 mL 注射器,1s内注入溶于注射用生理盐水的浓度为1mg/mL 的LPS 0.2mL(200 μg),将大鼠直立,左右旋转,使LPS在肺内均匀分布。第2天~第16 天给予大鼠每天2 次香烟烟熏,每次点燃烟丝的重量为9.03g(每支烟烟丝重量为0.645g),持续时间1h,间隔4h(滴LPS当天不烟熏)。被动吸烟方法:将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱(40cm×45cm×50cm)内,香烟点燃后,用60mL 注射器吸满烟雾,然后通过三通管将香烟烟雾快速注入染毒箱内(操作频率为20次/min),进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧产生的水蒸气对大鼠的影响,在箱底放置适量硅胶干燥剂。继续饲养90d,第91 天起,在模型组基础上,NAC低、中、高剂量组分别按26.32、52.64、105.28 mg/kg NAC灌胃(ig),连续2周。剂量计算参考文献[5]药动学研究中给药剂量标准进行折算,按单体折成平均临床等效剂量约52.64mg/kg。高剂量约为2倍于平均临床等效剂量(105.28mg/kg),中剂量为等量平均临床等效剂量(52.64 mg/kg),低剂量为1/2平均临床等效剂量(26.32mg/kg)。对照组、模型组大鼠每天给予2mL 生理盐水ig,相同室内环境下自由饮食饮水。
1.2.2 血管活性物质检测 取静脉血2mL,离心(4℃,1 000r/min,10min),分离血清,置-70℃冻存。采用硝酸还原酶法测定血清NO,采用比色法测定血清ROS,黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD;硫代巴比妥酸法测定MDA;取静脉血2 mL,加入30μL的100g/L EDTA Na2和40μL 抑肽酶,离心(4℃,4 000r/min,10 min)分离血浆,置-70℃冻存。采用放免法测定血浆ET;取静脉血5mL,加入冰浴的酶抑制剂30μL和0.3mmol EDTA Na2,离心(4℃,1 000r/min,5min),分离血浆,置-70℃冻存,采用放免法在冰浴中测定AngⅡ。均严格按说明书操作进行检测。
1.2.3 NF-κB 活性表达检测 取肺组织采用免疫组化SABC法测定,按试剂盒说明书进行操作,NF-κB 活性表达以NF-κB阳性细胞率表示,高倍光镜下随机观察10个视野,至少计数1 000个细胞,取其阳性细胞数平均值为该组的细胞阳性率。
1.2.4 统计学处理 数据统计采用SPSS 13.0软件。计量资料用均数±标准差(±SD)表示。组间比较用单因素方差分析及t检验。采用Spearman方法分析相关性,P<0.05为差异有统计学意义。
与对照组比较,模型组AngⅡ、ROS、ET、MDA水平均极显著升高(P<0.01),而NO、SOD 水平均极显著下降(P<0.01)。与模型组比较,低剂量组NO 水平升高、ET 水平显著下降(均P<0.05);中剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平显著下降或极显著下降(P<0.05或P<0.01),而NO、SOD 水平均显著升高(均P<0.05);高剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均极显著下降(P<0.01)而NO、SOD 水平均极显著升高(均P<0.01)(表1)。
表1 各组血管活性物质水平比较Table 1 Comparison of the levels of vasoactive substances in each group
与对照组比较,模型组NF-κB阳性细胞率极显著升高(P<0.01);与模型组比较,低剂量组NF-κB阳性细胞率下降,但差异没有统计学意义(P>0.05),中剂量组NF-κB 阳性细胞率显著下降(P<0.05),高剂量组NF-κB 阳性细胞率极显著下降(P<0.01)(图1)。
图1 各组NF-κB活性表达比较Fig.1 Comparison of NF-κB activities in each group
AngⅡ 水平与NF-κB 活性,AngⅡ 水平与ROS水平均呈显著正相关关系,r值分别为0.835和0.864(P<0.01)。
COPD 发病机制的研究集中于气道炎症及感染、蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡、黏液分泌过多和小气道阻塞方面[6],但近来的研究显示氧化应激损伤在COPD 发病机制中有重要影响[7],各种类型的氧化剂通过损害血清蛋白酶抑制剂,加强弹性酶的活性和增加黏液的分泌参与COPD 的病理过程[8],氧化剂还通过直接氧化,作用于花生四烯酸而产生异前列腺素,其对气道产生多种效应,包括支气管缩窄、血浆漏出增加和黏液过度分泌[9]。此外,氧化剂能活化转录NF-κB,NF-κB可协助转录其他许多炎症因子而加重COPD 病理改变[10]。
NF-κB 的活化过程可被抗氧化剂等抑制,抗氧化剂能对抗氧自由基的损伤,抑制ROS介导的激活NF-κB 的过程,此类抗氧化剂的代表如NAC。NAC是一种含-SH 的小分子化合物,易于进入细胞并在细饱内去乙酸化后生成L-半胱氨酸,提供合成细胞内重要的非酶类抗氧化物还原型谷胱甘肽(GSH)的底物,补充细胞内GSH 的含量,对抗ROS等氧化损伤。
由于氧化应激反应引起机体AngⅡ分泌水平升高,诱导ROS等的产生[11],大量的ROS氧自由基使舒血管物质NO 失活,缩血管物质ET 大量产生,使对血管舒缩功能具有调节作用的NO/ET失衡,同时,由于炎症因子的损害作用,SOD 活性降低而MDA 活性表达上升[12]。氧化应激造成血管损伤、血浆漏出增加、加重炎症及感染,这些因素加重COPD 症状,使临床治疗COPD 耗时低效。在本试验中,观察到与对照组比较,模型组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均显著升高,表明氧化应激损伤引起COPD 病理变化,同时,模型组NF-κB 阳性细胞率显著升高,与对照组比较差异也有统计学意义,表明COPD 炎症加重,此外,相关性分析结果显示AngⅡ水平与NF-κB 活性以及AngⅡ水平与ROS水平均呈显著正相关,提示降低AngⅡ水平,从而减少ROS的产生,进而抑制NF-κB 活化过程是改善COPD 氧化损伤的一条途径。
采用NAC 干预后,观察到与模型组比较,低剂量组NO 水平显著升高、ET 水平显著下降;中剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平显著下降或极显著下降而NO、SOD 水平均显著升高;高剂量组AngⅡ、ROS、ET、MDA 水平均显著下降而NO、SOD 水平均极显著升高,说明NAC 能改善COPD 氧化损伤,但与剂量有关,低剂量效果不明显,以高剂量改善效果明显,提示临床上治疗COPD 可能需要较大的剂量。综合本试验结果,推测NAC 可能通过调节AngⅡ水平,抑制ROS 以及NF-κB 活化,提高SOD 等水平发挥抗氧化应激损伤作用的,也为新型抗氧化剂的开发提供了思路。
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