驽巴贝斯虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

张 杨，达伊力特，刘 进，李 佳，巴音查汗＊

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐，830052；2.新疆和静县畜牧兽医站，新疆和静841300；3.新疆和静县巴音布鲁克镇兽医站，新疆和静841300）

驽巴贝斯虫（Babesia caballi）是经由蜱传播，寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的一种血液原虫［1-2］。牲畜感染驽巴贝斯虫后多出现发热、贫血、黄疸、食欲不振、厌食、消瘦等症状，急性病例会发生死亡［3-4］。该病呈世界性分布，在美洲、非洲、亚洲、欧洲、大洋洲均有驽巴贝斯虫病的相关报道［5-6］。近年来，驽巴贝斯虫病呈逐渐上升趋势，给该病的防控带来了严峻的考验［7］。目前，驽巴贝斯虫的检测手段主要有临床诊断、血液涂片镜检、免疫学诊断方法和分子生物学方法［8］等。我们课题组前期试验研究，曾赴巴音布鲁克焉耆马场和昭苏马场进行了有关马常见寄生虫的流行病学调查，发现马蜱传梨形虫病和消化道寄生虫较普遍感染马匹，且前者的急性病例若不及时诊治，常会导致患马死亡的现象。传统的血液涂片镜检方法虽然方便、直观，但检测的准确性远远达不到要求。PCR 方法［9］是一种敏感、特异、快速的诊断方法，二温式PCR 较常规PCR 方法而言，具有省时、减少非特异性扩增等特点［10］。本研究根据马驽巴贝斯虫棒状蛋白Bc-48基因［11］的稳定区设计了一对特异性引物，建立了一种快速检测驽巴贝斯虫的二温式PCR 方法，经初步用于临床样品的检测，表明具有一定的临床使用价值，可为今后驽巴贝斯虫病的早期诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 阳性虫种 驽巴贝斯虫（B.caballi）、马泰勒虫（Theileria equi）、双芽巴贝斯虫（B.bigemina）、环形泰勒虫（T.annulata）、瑟氏泰勒虫（T.sergenti）等阳性DNA 由新疆农业大学动物医学学院实验室保存。

1.1.2 临床样品 临床样品采自和静县巴音布鲁克地区（焉耆马匹的分布区域）疑似感染驽巴贝斯虫的抗凝全血，共82份。

1.1.3 试剂 全血基因组提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；pEASY-T1 载体购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR 试剂（TaqDNA 聚合酶、MgCl2、dNTPs、10×PCR buffer（Mg2＋free））、DNA Marker DL 2 000、限制性核酸内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.4 仪器设备 紫外分光光度计（nanodrop 2000c）为Thermo公司产品；梯度PCR 仪（Professional Thermocycler）为Biometra公司产品；凝胶成像系统（G：BOX）为Syngene为公司产品；恒温摇床（TS-2102C）为天呈公司产品；离心机（SIGMA 1-14）为SIGMA 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 设计引物 根据GenBank 中驽巴贝斯虫Bc-48基因序列（登录号：AB731211）保守区，应用Primer Premier 5.0和Oligo6.0软件设计了一对特异性引物，Bc48-F：5′-CGCATTTGCAGTCAGGTC-3′，Bc48-R：5′-TGGTAGGGCTCAGGAAGG-3′；由北京鼎国生物技术公司合成。

1.2.2 基因组DNA的提取 按照全血基因组提取试剂盒说明书提取被检马匹全血DNA，置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 反应体系及反应条件的筛选 以提取的驽巴贝斯虫DNA 为模板，PCR反应条件：94℃3min；94℃15s，55℃45s，30个循环；最后72℃3 min。退火延伸温度梯度为53℃～62℃，退火延伸时间梯度为15s、30s、45s、1min。

1.2.4 重组质粒及序列比对 将确定的阳性DNA进行PCR 试验，PCR 产物使用胶回收试剂盒回收和纯化，将回收、纯化后的PCR 产物与pEASY-T1载体连接，转化至感受态细胞E.coliDH5α中，将其置于含氨苄青霉素的LB 固体培养基中过夜培养，挑取白色单菌落接种于含氨苄青霉素LB 液体培养基中培养，提取阳性质粒进行PCR鉴定，并送至北京鼎国生物技术公司进行测序分析。

1.2.5 敏感性试验 对提取的驽巴贝斯虫阳性DNA 用紫外分光光度计测定OD260nm 值，计算DNA 的浓度（原始浓度为228ng／μL），对该模板进行10倍倍比稀释至10-9，采用优化后的最佳反应条件进行二温式PCR 扩增，测定最低模板检测量。

1.2.6 特异性试验 分别以驽巴贝斯虫、马泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫的DNA 为模板，双蒸水为空白对照，进行特异性试验。

1.2.7 临床应用 应用建立的二温式PCR 方法对82份临床样品进行检测，同时进行血涂片镜检，对比二者的临床利用情况。

2 结果

2.1 PCR反应体系及退火-延伸温度和时间的筛选

应用均匀设计方法对二温式PCR 优化最佳反应体 系 为：反 应 体 系（25 μL）：10×PCR buffer（Mg2＋free）3μL，MgCl2（25 mmol）2μL，dNTPs（2.5mmol）2μL，上下游引物（10μL）1μL，TaqDNA 聚合酶（5U／μL）0.2μL，模板DNA 2μL，灭菌双蒸水补足至25μL。优化反应条件：94℃3 min；94℃15s，55℃45s，30个循环；最后72℃延伸5min（图1）。7号泳道的PCR 产物条带最亮，因此将7 号泳道的体系设为最优反应体系。PCR 产物进行12g／L 琼脂糖凝胶电泳，扩增出条带大小为155bp的电泳条带，与预期设计的目的片段大小相符（图2）。

2.2 重组质粒鉴定及重组序列的比对结果

将小量提取的DNA 进行二温式PCR 试验，得到与目的片段大小相同的大小约为155bp特异性条带（图3），说明重组质粒提取成功且重组质粒对建立的PCR 方法敏感。将鉴定为阳性的重组质粒送至北京鼎国生物技术公司测序，测序结果得到的目的基因与引物设计时所选片段（GenBank序列号：AB731211）的同源性为98%（图4）。

图1 PCR反应体系及循环条件的优化Fig.1 Optimization of the reaction system and circulation condition of PCR

图2 PCR 产物的电泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of PCR products

图3 重组质粒PCR鉴定Fig.3 PCR identification of recombinant plasmid

图4 PCR 扩增产物序列比对结果Fig.4 Sequence alignment result of PCR amplification products

2.3 敏感性试验结果

对该模板以10倍梯度进行倍比稀释，采用优化好的反应条件进行PCR 扩增，结果显示当模板DNA（228ng／μL）倍比稀释至10-8时，PCR 扩增时无条带出现，即该二温式PCR 最低能检测出的样品拷贝数为5.17×102copies／μL（图5）。如图5 所示，第1泳道至第9泳道都有条带，条带在155bp左右，与目的条带大小相符，第1泳道至第9泳道，条带亮度依次减弱，条带宽度依次变窄，说明随着模板DNA 浓度依次降低，条带的亮度依次减弱。

图5 PCR 敏感性试验结果Fig.5 The results of PCR sensitivity experiment

2.4 特异性试验结果

以驽巴贝斯虫、马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫的DNA 为模板，按照最佳反应条件进行PCR反应后，结果驽巴贝斯虫有特异性条带，其他虫种均无条带，说明建立的方法对驽巴贝斯虫具有良好的特异性（图6）。1号泳道出现特异性条带，条带大小约为155bp左右，与目的片段相符。条带清晰无二聚体和非特异性扩增，而其他含有马泰勒虫等DNA 的泳道无PCR 产物出现。

图6 PCR 特异性试验结果Fig.6 The results of PCR specificity experiment

2.5 临床应用结果

对采集于新疆驽巴贝斯虫高发地区的82份全血样品进行了血液涂片镜检和二温式PCR检测。该区样品血液涂片检测结果阳性率为37.80%（31／82），经二温式PCR检测后阳性率为69.51%（57／82），其中血液涂片检测为阳性的样品经二温式PCR检测均为阳性，因此该二温式PCR检测方法在临床应用上相较血液涂片镜检的检出率更高效。

3 讨论

本试验所建立的二温式PCR检测方法是利用较短的DNA 片段，将退火和延伸合并为一步，使二温式PCR 可以和普通三温式PCR 一样扩增出相当数量的产物［12］。当退火和延伸结合为一步后，更容易保证产物的特异性，更适合于大规模群体监测高通量检测，同时避免了常规的三温式PCR检测方法需要经历变性、退火、延伸三步反应繁琐、耗时［13］的缺点，可用于马梨形虫感染早期的诊断。

在建立二温式PCR 方法时，本试验对影响PCR 的几种因素采取了均匀设计的方法筛选优化反应体系［14］，最终选取了最优的体系。本试验特异性地扩增出了大小为155bp条带，与设计的引物条带大小相符，亦与马驽巴贝斯虫阳性DNA 条带一致，而其他梨形虫阳性DNA 未出现条带。对二温式PCR 方法获得的驽巴贝斯虫阳性DNA（初始浓度为228ng／μL）进行了倍比稀释至5.17×102copies／μL，发现仍可通过PCR检测到阳性DNA（155 bp），说明该方法最低可检5.17×102copies／μL 拷贝数的样品。

本试验以马驽巴贝斯虫棒状蛋白Bc-48基因序列为模板设计了的特异性引物，该蛋白目前被认定专门应用于虫种鉴别上的特异性蛋白，且所建立的二温式PCR 方法在临床应用中具有快速、敏感、高效等特点［15］。本试验在应用所建立的方法来检测样品（采自于巴音布鲁克区域的焉耆马样品共82头份）时，将血液涂片结果和二温式PCR检测结果进行了对比，发现血液涂片对检测小样本确实具有直观、高效等优点，但检测大量临床样本时，稍显耗时、低效，而二温式PCR 方法较快速、灵敏、准确，同时较常规PCR 诊断方法也省时省力，为马驽巴贝斯虫病的临床诊断和流行病学调查提供了技术手段。

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