牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的原核表达及鉴定

范 晴，谢芝勋，谢志勤，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，罗思思

（广西兽医研究所，广西南宁530001）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）可引起的牛的致死性腹泻，呼吸及繁殖障碍，是养牛业中较为常见的传染病。临床特征为发热，腹泻，急、慢性黏膜病，白细胞减少，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制等，怀孕母牛感染BVDV后，可引起死胎、流产，胚胎畸形或分娩出表面看似正常的持续感染的犊牛［1-2］。目前BVDV的检测方法主要有RT-LAMP，RT-PCR，实时荧光定量PCR等［3-4］。这些方法虽然快速，但只有BVDV牛呈急性腹泻时才可以从排泄物中直接检测到病毒粒子。然而大多数牛感染BVDV是呈持续性感染，不表现临床症状，这些持续感染的犊牛一旦再次接触BVDV相似性抗原就会继发为黏膜病，表现为急性脱水性腹泻，病死率可高达100%，即使不成为黏膜病也终身带毒，持续排毒，是养牛业潜在的危害，可造成重大的经济损失。只有检测BVDV抗体才能真正确诊BVDV持续感染的牛。该病的防控主要依靠检测出这些持续性感染的牛并淘汰，逐步净化牛群［5-6］。由于BVDV仅有一种血清型，因此本研究利用原核表达系统体外表达NS3基因，目的是获得有免疫活性的BVDV NS3囊膜蛋白，制备出具有良好反应原性的抗原，为BVDV野毒感染检测试剂盒的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BVDV分离株Oregon CV24冻干毒及标准BVDV阳性血清均购于中国兽药监察所；MDBK 细胞购自武汉中国典型培养物保藏中心；Pet-32a原核表达载体购自Novagen公司，限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ、PMD-18T 克隆载体、DNA Marker、T4连接酶购自TaKaRa公司；NC膜购自Invitrogen公司；质粒小量提取试剂盒、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒，反转录试剂盒购自TransGen公司；兔抗牛IgG／辣根酶（HRP）标记购自KPL 公司；蛋白纯化试剂盒购自北京康为公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取Oregon CV24毒株参照文献在MDBK细胞上增殖，48h收获病毒，反复冻融3次后，离心取上清，参照Invitrogen公司Trizol说明书抽提病毒RNA，用TransGen公司的cDNA Synthesis SuperMix 进行反转录，置-20℃备用。

1.2.2 引物设计和PCR 扩增 根据GenBank 中的Oregon CV24基因序列（Genbank登录号：0911605.1），利用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，扩增NS3基因，扩增的目的片段为1 206bp，引物均由Invitrogen公司合成，下划线部分分别为SalⅠ和NotⅠ酶切位点。NS3 上：5′-GTCGACTTACCAGTATGAACAGGGGAG -3′，NS3 下：5′-GCGGCCGCTGTTGTATGCAAGTTGGATTG-3′。

1.2.3 表达载体的构建 用胶回收试剂盒纯化PCR 产物，连接入PMD-18T 克隆载体，转化入大肠埃希菌DH5α，用PCR 筛选阳性克隆，构建PMD-18T-NS3。抽提PMD-18T-NS3质粒和Pet-32a质粒，两种质粒同时用SalⅠ和NotⅠ双酶切后，把NS3片段与酶切后的pET-32a载体用TaKaRa T4连接酶进行连接，转化大肠埃希菌Transetta（DE3），置37℃培养过夜。次日，挑取单菌落，经PCR鉴定，阳性菌送上海Invitrogen公司测序。将构建的重组质粒pET-32a-NS3，用限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行双酶切。

1.2.4 重组蛋白的可溶性鉴定 将测序正确的阳性菌液以1∶100的比例接种于50 mL LB＋AMP的培养液中，37℃摇床培养至OD600nm 值为0.55～0.65 时，向重组菌中加入IPTG 至终浓度为1 mmol／L进行诱导表达，30℃继续培养8h后收集菌液，10 000r／min离心15min，弃上清，用5mL PBS重悬菌体沉淀，加入溶菌酶（终浓度为100μg／mL），混匀后，置37℃和-70℃之间反复冻融3次，冰浴进行超声波裂解，破碎菌体直至菌液呈清亮，10 000 r／min离心10 min，分别取上清与沉淀进行SDSPAGE电泳，以确定重组蛋白表达产物的表达方式，如果主要的表达产物在上清，则该蛋白为可溶性表达，如果主要的表达产物在沉淀，则该蛋白为包涵体表达。

1.2.5 重组蛋白的纯化 参照康为公司Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）说明书进行纯化。将洗脱蛋白装入已处理过的透析袋里，并把透析袋置于复性缓冲液（1×PBS，1 mmol／L EDTA，尿素，pH 8.0）中，于4℃逐步透析复性，复性缓冲液中尿素浓度不断下降，依次顺序为4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0mol／L，换液间隔时间为10h～12h。透析结束后，收集蛋白进行SDS-PAGE 电泳，确定复性和纯化的效果。

1.2.6 Western blot检测 纯化好的NS3蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，用上海Invitrogen 公 司Western blot干转仪，将蛋白条带转到硝酸纤维素膜（NC膜）上，同时设空菌体对照。NC膜用50g／L脱脂奶37℃封闭1h～2h，用PBST洗涤3次；加入1∶100稀释的BVDV 标准阳性血清，37℃孵育1h后，再用PBST洗涤3次；加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG，37℃孵育1h，PBST 洗膜3次；最后用DAB显色，观察结果。

2 结果

2.1 重组质粒pET-32a-NS3的鉴定

将构建好的pET-32a-NS3表达载体用PCR鉴定，NS3片段已成功插入载体中（图1）。双酶切鉴定重组质粒，可成功地从pET-32a-NS3中切出NS3片段，大小为1 206bp，空载体pET-32a未切出条带（图2）。重组质粒测序结果显示，NS3 主要抗原区已成功插入pET-32a 载体中，与GenBanK 中的BVDV 核苷酸同源性为91%～100%，氨基酸同源性在94%以上。

图1 PCR鉴定结果Fig.1 The results of PCR identification

图2 Pet-32a-NS3重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid Pet-32a-NS3by double enzyme digestion

2.2 重组蛋白的可溶性鉴定

经IPTG 诱导后，重组NS3蛋白得到较好表达，超声波破裂细菌后取上清和沉淀分别进行SDSPAGE，NS3的表达产物主要在沉淀部分，即为包涵体表达形式（图3）。

2.3 重组蛋白纯化结果

经试剂盒纯化后，得到较高浓度与纯度的NS3蛋白。经OD260nm 和OD280nm 检测分析，NS3的浓度分别为2.08mg／mL。通过SDS-PAGE检测重NS3组蛋白的纯度，结果显示，纯化的效果较好，均可得到单一的目的条带，无杂带（图3）。

2.4 Western blot结果

用BVDV 阳性血清进行Western blot检测，结果显示，NC膜上重组NS3蛋白出现清晰的特异性印迹条带，而空菌体对照无特异性条带，表明重组NS3蛋白反应活性较好（图4）。

图3 NS3在大肠埃希菌中表达产物的SDS-PAGE检测Fig.3 SDS-PAGE of NS3expression products in E.coli

图4 NS3重组蛋白的Western blot检测结果Fig.4 Western blot detection results of NS3recombinant proteins

3 讨论

据报道BVDV 在我国广泛存在，安徽、江苏、广西省（区）BVDV 感染率为分别为34.2%、8.4%和10%［7］。大部分情况下BVDV 以持续性感染而不发病的形式存在于牛体内，持续排毒成为潜在的感染源。由于BVDV 发病机理及临床特征的复杂性，只有当BVDV 牛呈急性腹泻时才可以从排泄物中直接检测到病毒粒子，因此用RT-PCR、RT-LAMP等一系抗原检测技术容易漏检。BDVD 抗体的检测才能对持续性感染的牛进行确诊，真正监测畜群BVDV 的感染状况。选择NS3 蛋白表达的理由如下：①NS3具有较高的免疫原性，是一种免疫优势蛋白，在病毒感染过程中，免疫系统的CD4＋T 细胞主要识别NS3 和E2 两种蛋白，并可诱导免疫细胞产生针对该蛋白的抗体［8］。②核苷酸序列分析表明，NS3编码区不仅在BVDV 各毒株间都较保守，且在不同基因型（BVDV-1和BVDV-2）和生物型（细胞病变型和非细胞病变型）中也是非常保守的［11］。③目前国际上对该病的控制主要依赖BVDV 灭活疫苗，NS3是BVDV 的非结构蛋白，当灭活疫苗刺激机体时，主要产生的针对结构蛋白的抗体，因此对NS3抗体的测定，将有助于区分疫苗免疫和野毒感染［9-11］。利用原核表达系统在体外表达蛋白，可获得高纯度的蛋白，用于ELISA 诊断抗原不仅制备方便，安全，而且特异性好，在动物疫病的诊断上得到广泛应用［12-14］。

本研究制备的BVDV NS3蛋白能与BVDV 阳性血清发生特异性反应且浓度高，适合于下一步大量的制备，为建立BVDV ELISA 检测试剂盒奠定基础，用于区分疫苗免疫和野毒感染。

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