美洲型和欧洲型PRRSV RT-PCR鉴别检测方法的建立

戴光文，谢丽华＊，江精华，李 媚，梁 真，苏志毅，严 红

（1.梧州市动物疫病预防控制中心，广西梧州543002；2.梧州市动物卫生监督所，广西梧州543002）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，又称猪蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性传染病，以母猪繁殖障碍、仔猪高病死率、发热、蓝耳、呼吸困难为特征。该病于1987年首次在美国报道［1］，此后世界各地均有发生。欧美先后分离到病原，分别被鉴定为欧洲型和美洲型两种基因型。我国在1996年首次分离到美洲型PRRSV［2］，迄今国内以该型毒株流行为主。2006年在我国南方高热猪群中发现美洲型PRRSV NSP2基因发生缺失变异［3］，形成具有高致病性的毒株，对养猪业危害巨大。当前我国猪群同时遭受美洲型PRRSV 高致病性毒株和经典毒株的侵害［4］，两种毒株引起的猪群症状和病变几乎相同，难以从临床上进行区分，逐一进行实验室鉴定存在耗时过长、浪费试剂等缺点。本研究旨在建立可以同时检测美洲型PRRSV 高致病性和经典毒株的RT-PCR鉴别方法，并以此开展猪蓝耳病的快速诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 总RNA 提取试剂盒和DNA Marker（TIANGEN）；M-MLV 逆转录酶、重组核酸酶抑制剂、TaqDNA 聚合酶和dNTP Mix（Invitrogen）；核酸染料GelRed（Biotium）；猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp2 1594～1680变异株）RT-PCR检测试剂盒（北京世纪元亨），用于比较试验。

1.1.2 仪器设备 PCR 仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统（珠海黑马公司）；电泳仪槽（君意JY600C）、微量移液器（芬兰Beta）、二级生物安全柜（BHC-1300ⅡA2）等。

1.1.3 参照物 变异株TJM-F92、经典株CH-1R活疫苗（每头份不少于105.0TCID50）分别用于PRRSV 两种毒株的阳性对照。猪瘟（细胞源）、猪伪狂犬病（HB-98株）、猪乙型脑炎（SA14-14-2株）、猪传染性腹泻-猪流行性腹泻-轮状病毒三联活疫苗用于特异性试验。

1.1.4 样品来源 10份猪血清（编号X1～X10）采自散养户临床无症状猪，6份猪组织（编号Z1～Z6）为屠宰场猪有病变的肺、脾、淋巴结混样。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank 登陆的美洲型PRRSV TJ株（登录号EU860248）、CH-1a株（登录号AY032626）及其他毒株核苷酸全序列，综合利用Primer 5.0和Oligo 6生物软件分析，设计一对可以同时扩增变异毒株和经典毒株NSP2基因的特异性共有引物（位于NSP2不连续缺失90个核苷酸位点两端，上游引物P1：5′-TCCACCAAGAGTTCAACCT-3′，下 游 引 物P2：5′-GACGCAGACAAATCCAGAG-3′），预期扩增基因片段分别为342bp（变异毒株）和432bp（经典毒株）。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 抽提和RT-PCR 取稀释后的活疫苗或临床样品上清液200μL，按照总RNA 提取试剂盒和逆转录酶说明书提取RNA 和进行RT。对PCR 反应体系进行优化，最终确定为10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（50mmol／L）0.75μL，上、下游引物（10 μmol／L）和dNTP Mix（10 mmol／L）各0.5μL，DNA 聚合酶（5U／μL）0.2μL，反转录产物1μL，加灭菌水至25μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35 个循环；72℃延伸10min。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 配制新鲜的1×TAE 电泳液和12g／L琼脂糖凝胶（经GelRed染色），每孔加入PCR 产物8μL，电压8V／cm，室温25℃，电泳后拍照。

1.2.4 特异性、敏感性、重复性和比较试验 利用灭菌生理盐水将猪瘟、猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪传染性腹泻-猪流行性腹泻-轮状病毒等活疫苗稀释后作为待检样品进行RT-PCR 特异性试验。将TJM-F92株、CH-1R 株 活 疫 苗 按 照101、102、103、104、105、106倍连续稀释后进行RT-PCR 敏感性扩增。用本研究方法对10份临床样品进行3次重复检测，并与商品化试剂盒检测比较。

1.2.5 临床应用 对临床16份样品进行检测。

2 结果

2.1 RT-PCR建立及特异性试验结果

CH-1R、TJM-F92均扩增出预期大小的目的片段（即432bp和342bp），阴性对照、猪瘟、猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪传染性腹泻、猪流行性腹泻、轮状病毒没有扩增出条带（图1）。

图1 RT-PCR 特异性检测Fig.1 RT-PCR specificity assay

图2 变异株敏感性试验Fig.2 The sensitivity test of the variant strain

2.2 敏感性试验结果

反应体系能扩增出105倍稀释的变异株模板（图2）和104倍稀释的经典株模板（图3），可以检测出低至101TCID50的病毒感染量。

2.3 重复性试验及与商品化试剂盒比较结果

图3 经典株敏感性试验Fig.3 The sensitivity test of the classic strain

对猪血清（X6～X10）和猪组织（Z1～Z5）利用本法重复3次检测，样品X9、Z1、Z4、Z5为PRRS变异株阳性，其他样品为阴性，3次结果无差异。利用商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp2 1594～1680变异株）RT-PCR检测试剂盒检测，阳性出现278 bp，结果与研究建立的方法符合率100%（图4）。

2.4 临床样品检测结果

从散养户和屠宰场16份样品中检测出经典株阳性1份（图5血清X2），变异株阳性5份（图5血清X9；图6 组 织Z1、Z4～Z6），总体阳性率为37.5%，变异株占总毒株数的83.3%。

图4 商品化试剂盒检测结果Fig.4 Detection results by commercial kit

图5 猪血清检测结果Fig.5 Detection results of pig sera

图6 猪组织检测结果Fig.6 Detection results of pig tissues

3 讨论

PRRSV 诊断方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）［5］、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）［6］、血清病毒中和试验（SVN）［7］、直接免疫荧光试验（IFA）［8］、病毒分离鉴定［9］、核酸序列测定［10］、针对单一PRRSV 毒株的反转录-聚合酶链反应（RTPCR）［11］等。前3 种方法常用于抗体检测，不能区分免疫抗体和野毒感染抗体。IFA、病毒分离鉴定、核酸序列测定可以准确地对病原做出鉴定，但耗费较长时间，不适合快速诊断。常规非鉴别性RTPCR 方法虽然快速，但是无法同时检测变异株和经典株感染。本研究利用美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株相对于经典株在NSP2基因上不连续缺失90个核苷酸的标志特征，设计特异性共有引物，可以同时快速对2种毒株进行鉴别检测。琼脂糖凝胶电泳技术对相差90bp 的2 个较大分子量片段（500bp以上）很难用肉眼分辨，因此本研究设计的引物扩增片段（432bp和342bp）在标准分子质量400bp条带附近，电泳后用肉眼清晰辨别，不用测序即可快速鉴别。

试验表明本研究建立的方法具有良好特异性、敏感性、重复性和可靠性，只能扩增出美洲型PRRSV 基因，猪群当中常见的CSFV、PRV、JEV、TGEV、PEDV、RV 等病毒不会干扰结果，可扩增出低至101TCID50的病毒感染量，可以与国内优秀商品化试剂盒媲美。该法需要注意，1孔DNA Marker最多给予6个样品提供参照，否则电泳斜度可能造成分辨误差。在电泳过程中要控制电压温度，并且使用新配置的电泳液和凝胶才能跑出良好效果。

临床上从猪血清、猪组织中都可以检测出PRRSV，表明建立的方法可以用于活体猪常规监测，也可以用于病死猪鉴定检测。猪血清阳性率（2／10）低于猪组织阳性率（4／6），这与PRRSV 侵入机制、细胞受体和体内分布有关［12-13］。PRRSV 主要侵害含有巨噬细胞的器官如肺脏、淋巴结等，在肺脏中含量高且维持时间长，在血液中含量稍低且维持时间短。变异株所占总毒株的83.3%，表明当前猪群主要以高致病性变异毒株流行为主，这与相关报道结果一致［14-16］。通过检测发现，屠宰场和散养户都是猪蓝耳病发生风险点，要加强监控。

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