神经生长因子控释凝胶促进大鼠周围神经损伤后再生的研究

王利兵 敖强

【摘要】目的：运用纤维蛋白胶(FG)结合神经生长因子（NGF）包裹SD大鼠坐骨神经断端，通过纤维蛋白胶控释NGF以促进神经纤维再生并减少神经吻合口瘢痕形成。方法: SD大鼠24只，随机分为2组 ，每组12只。 A组：大鼠坐骨神经切断后神经外膜直接缝合，然后吻合口包裹 FG/NGF凝胶，B组：神经外膜直接缝合，吻合口未包裹凝胶。分别于术后第1、3、5、7周行术侧足迹实验检测，术后2月行术侧三头肌湿重恢复率测量、电生理测定、甲苯胺蓝染色、透射电镜分析等。结果:同一时间段两组间比较，各指标A组明显好于B组。结论：NGF缓释凝胶可以促进大鼠坐骨神经离断损伤的修复并防止吻合口与周围组织粘连。

【关键词】神经生长因子；纤维蛋白凝胶；周围神经；损伤；再生；

【Abstract】Objective：To evaluate the effect of the controlled release of biodegradable FG ,nerve growth factor (FG/ NGF) on peripheral nerve defect. Methods ：towenty-four Sprague2 Dawly rats were randomly divided into two groups, FG/ NGF(group A , n = 12),Stitching of combine (group B ,n = 12).Each rat underwent right sciatic nerve cuting into two pieces，then these defects were repaired in the two different experimental groups.The process of the peripheral nerve regeneration was evaluated at 2 months following operation,and the evaluated items were footprinting test, triceps weight ,electrophysiological ,Immunohistochemistr ,Methylene, Blue trihydrate axon morphologic assessment of the outcome of nerve regeneration. Results：Nerve regeneration in group A was comparable with that seen in natuai Nerve and was significantly superior to that in B groups in all indexes. Conclusion：: FG/ NGF controlled release was a potential ideal， that can effectively promote nerve regeneration after sciatic nerve defect of rats. The effect was as good as that of natual Nerve.

【key words 】 NGF; FG； Peripheral nerve； Nerve defect； Rgeneration

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)06-0200-01

材料与方法

1．主要试剂及设备：重组大鼠NGF及bFGF,NF200及S100兔抗鼠抗体，纤维蛋白凝胶，电生理仪及信息采集系统等。健康幼年雄性 SD 鼠 24 只，体重 250～300 g ,随机分为 A（实验组）、 B (对照组）两组 ,每组12 只；该课题研究所用动物（SD鼠）、全部的手术流程，以及SD鼠的全部喂养流程全部符合1996年版《北京市实验动物管理条例》的相关规定。

2．动物实验模型制作：所有大鼠的手术部位为右大腿 ,左大腿设为正常对照。术区常规备皮，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于大鼠右股后外侧行纵形切口,显露坐骨神经约2. 5 cm。A 组于右侧坐骨神经上中段横行切断后以11-0无创显微缝合线外膜缝合法连续缝合4针，将配置好的FG/ NGF取适量涂抹于吻合神经断端，最后将肌肉和皮肤逐层缝合，并在切口处涂抹少许青霉素粉末。B组手术方法同A组，但神经吻合断端只行外膜缝合，未予FG/ NGF涂抹。术后8周行足迹试验、神经电生理测定、三头肌湿重比、组织学检测等。

3．坐骨神经功能指数（SFI）：是公认的用来评定术后坐骨神经运动功能恢复情况的一项重要指标。术后8周测定各组SFI值。SFI为0提示坐骨神经功能正常，SFI为-100提示坐骨神经功能基本完全丧失。

4．神经电生理测定：我们于术后 2月行动物实验，将局部坐骨神经充分游离 ,避免损伤坐骨神经外膜，将刺激电极插入吻合口近端的神经干上 ,在小腿三头肌处插入记录电极(丹麦产高性能诱发电位/ 肌电图检测仪 4000 型)用于测量该段坐骨神经运动神经传导速度，及潜伏期的长短；

5．三头肌湿重比测量：术后8周完整切取大鼠双侧三头肌,沾去附着的血液 ,用天平称量湿重 ,进行双侧对比，以观察肌肉恢复率(实验侧/ 正常侧) ；

6． 组织学检查：神经电生理测量完毕后，分别切取右侧坐骨神经吻合口部位远、 中、 近各段少许，做轴向切取 ,固定后48 h 备用. 最后将各段神经组织分别进行免疫组织化学测定、超薄切片透射电镜观察等组织形态学的观察和分析。

7．统计学分析：统计结果以（X±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，分析软件为spss软件，P<0.05为差别有统计学意义。

结果

1．SFI值：图1中描述了坐骨神经损伤修复术后3周、5周、8周大鼠患肢的SFI值。下面的坐标直方图很好的反应了术后不同阶段两组足迹实验所测值的变化。

（图1）足迹试验测定

图1：术后3、5、8周实验组（纤维蛋白凝胶神经生长因子）与对照组（直接缝合）的SFI值及其组间对比图；

2．神经电生理测定：动物手术，以坐骨神经吻合口为中心，游离坐骨神经，保护坐骨神经，防止损伤，保护神经外膜，选择长度为0.03m的坐骨神经段，计算各实验组（正常组、实验组、对照组）在该段坐骨神经的平均传导速度。如下表（1）

附表（1）

组别 术侧 健侧实验组

对照组 58±7.3

47±5.2 83±0.5

84±2.1注：各实验组于术后2月在该段坐骨神经的平均传导速度（X±sD，m∕s）

统计结果表明，对照组再生坐骨神经传导速度低于实验组再生坐骨神经传导速度，有显著性差异（P〈0.05）。而实验组与对照组再生神经的传导速度均明显低于健侧正常神经（P〈0.05）。

3．肌肉湿重比：图（2）描述了A组（实验组）和B组（对照组）神经修复术后2月各组手术侧和正常侧三头肌的湿重比值。图中显示术后手术侧的肌肉均发生一定程度的萎缩，但A组（实验组）肌肉湿重比（0.61）明显高于B组（0.43）。

（ 图2）肌肉濕重比图

4．坐骨神经超薄切片透射电镜观察：（图3）为A组和B组SD鼠坐骨神经损伤修复后8周，手术侧损伤中段的再生坐骨神经纤维、正常大鼠坐骨神经纤维横切面的超薄切片透射电镜图像。其中实验组轴突直径和髓鞘厚度与正常坐骨神经比较接近，但低于正常神经。而对照组的轴突直径最小，髓鞘厚度最薄，且神经纤维横截面不够规则。

正常神经纤维实验组中段神经纤维对照组中段神经纤维

（图3）

附表2为image-pro- plus软件分析的正常神经组织、A组（FG∕NGF）及（直接缝合）再生神经中段的有髓神经纤维的平均密度，轴突的直径，髓鞘的厚度等结果。

附表2

神经纤维密度（n∕mm2）髓鞘厚度（nm） 轴突直径（nm）实验组(A)：1125±686. 96±0. 71. 56±0. 154对照组(B)：904±47 5. 27±0. 62 1. 32±0. 046该表详细统计了实验组和对照组术后2月坐骨神经断端远端再生神经纖维密度、髓鞘厚度、轴突直径等各项相关指标的准确参数， 实验组和对照组2组坐骨神经远端都有神经纤维生长。但A组（FG∕NGF）再生神经干的神经纤维密度、髓鞘厚度、轴突直径等指标均优于对照组( P< 0. 05）。说明该方案（FG∕NGF） 对大鼠坐骨神经再生功效有明显的促进作用。

讨 论

应用外源性神经生长因子可以促进神经生长。但是目前多以全身用药方式为主，且用量大、副作用多。损伤局部应用缺乏理想的载体，因子释放时间短，不能维持长时间持续作用，因此寻找一种安全有效的神经生长因子控制释放的载体迫切而必要。而纤维蛋白是天然的血液成分，具有组织反应小、生物作用多等优点，其生物制品广泛应用于临床，具有成为神经生长因子载体的潜力。

实验从神经电生理测定、肌肉湿重比测定、组织学检测所得数据都明确的体现了实验组坐骨神经断端神经纤维的再生情况明显优于对照组。通过神经粘合口纤维蛋白胶缓慢释放神经生长因子(NGF)有效地促进神经纤维再生和成熟 ,且减少局部纤维瘢痕形成。

参考文献

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