环戊丙酸睾丸酮中有机溶剂残留量的检测

蒋燚,陈晶晶,田丰,杨敏

(湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

环戊丙酸睾丸酮中有机溶剂残留量的检测

蒋燚,陈晶晶,田丰,杨敏

(湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

目的 建立测定环戊丙酸睾丸酮中有机溶剂残留量的气-固顶空气相色谱法。方法色谱柱为DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),载气为高纯氮气,流速为1.5 mL·min-1,分流比为20∶1,柱温采用程序升温;检测器为氢火焰离子检测器(FID),温度230℃;进样口温度220℃;顶空加热温度70℃,顶空平衡时间40 min,以正丙醇为内标计算含量。结果甲醇、乙醇、苯、吡啶完全分离,分别在4.17～2.50×103μg·g-1(r=0.999 9),4.18～2.51×103μg·g-1(r=0.999 6),0.84～172 μg·g-1(r=0.998 1),2.95～1.77×103μg·g-1(r=0.999 9)范围内呈良好的线性关系;最低检出浓度分别为2.08,1.23,0.28,0.87 μg·g-1;加样平均回收率分别为102.2%(RSD=4.0%),99.6%(RSD=1.9%),112.6% (RSD=5.6%),98.9%(RSD=1.6%)。结论该法可靠、灵敏、准确,适用于环戊丙酸睾丸酮中有机溶剂残留量的测定。

环戊丙酸睾丸酮;有机溶剂残留量;色谱法,气-固顶空气相

环戊丙酸睾丸酮分子式为C27H40O3,是一种人工合成的雄性激素,易溶于二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。由于环戊丙酸睾丸酮在合成过程中使用甲醇、乙醇、苯和吡啶等有机溶剂,而这些有机溶剂在人用药注册技术国际协调会(international conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human Use,ICH)[1]列属规定控制限量的溶剂,故有必要对原料药中的有机溶剂残留进行检测。笔者曾采用气-液顶空色谱法,由于苯在DMSO溶液中溶解度较大,使其检测限高于《中华人民共和国药典》2010年版规定的限度。气-固顶空法样品无需溶剂溶解,从而避免上述问题。本实验根据ICH和《中华人民共和国药典》2010版附录[2]对有机溶剂残留量测定的指导原则,建立测定环戊丙酸睾丸酮原料药中甲醇、乙醇、苯和吡啶残留量的气-固顶空气相色谱法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent GC7890色谱仪,CTC Analytics HTC-PAL自动进样器,CHEMSTATIONS3.0色谱工作站(安捷伦科技有限公司),赛多利斯BP211D电子分析天平(德国赛多利斯股份公司),艾柯纯水器(成都唐氏康宁科技发展有限公司)。

1.2 试剂与药品 甲醇(上海振兴化工一厂,批号: 20130901-2,纯度:99.5%)、乙醇(上海振兴化工一厂,批号:20130425-3,纯度:99.8%)、苯(天津市福晨化学试剂厂,批号:20130201,纯度:99.5%)、吡啶(天津市化学试剂研究所,批号:20130301,纯度:99.5%)、正丙醇(广州化学试剂厂,批号:20130904,纯度:99.5%)均为市售色谱纯,无水碳酸钙(上海实意化学试剂有限公司,批号:20100701,纯度:99.0%,使用前于105℃烘箱中烘2 h),实验用水为超纯水,环戊丙酸睾丸酮原料(武汉三晶化工有限公司,纯度:99.6%,批号: 20120620)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱 DB-WAX毛细管色谱柱(3 0 m× 0.32 mm,0.25 μm);柱温:初温75℃(3 min),以30℃·min-1升至130℃,保留2 min;进样口温度: 220℃;氢火焰离子检测器(flame,ionization detector, FID)检测器温度:230℃;载气:高纯氮气;分流比: 20∶1;柱流速:1.5 mL·min-1。

2.1.2 顶空萃取条件 顶空加热温度:70℃;顶空平衡时间:40 min;进样量:250 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 内标物溶液的配制 取正丙醇0.251 5 g精密称定,置25 mL量瓶,用水稀释至刻度,混匀,即得10.06 mg·mL-1正丙醇内标储备溶液。取内标储备液稀释10倍,得1.01 mg·mL-1内标溶液。

2.2.2 对照品溶液的配制 分别取甲醇0.152 00 g、乙醇0.151 08 g、苯0.010 30 g,吡啶0.101 00 g精密称定,置10 mL量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,配成甲醇、乙醇、苯、吡啶浓度分别为15.20,15.11,1.030,10.10 mg·mL-1对照品储备液;取对照品储备液1 mL与内标液1 mL至10 mL量瓶,用纯水稀释至刻度,配成甲醇、乙醇、苯、吡啶、正丙醇浓度分别为1.52,1.51,0.103,1.01,2.01 mg·mL-1对照品溶液;取200 μL于10 mL顶空进样瓶中,加入无水碳酸钙0.3 g,压盖密封,即得。

2.3 分离度实验 取5种毛细管色谱柱HP-5(30 m× 0.32 mm,0.25 μm)、AT.SE-30(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)、AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm)、AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm)、DB-WAX (30 m×0.32 mm,0.25 μm),在同一色谱条件下进行比较。结果表明,HP-5和DB-WAX色谱柱各峰分离度(R)均大于1.5,峰形良好。但HP-5色谱柱中吡啶拖尾较严重,故最终选用DB-WAX色谱柱,见图1。

2.4 系统适用性测试 按上述色谱条件,取对照品溶液顶空进样,记录色谱图。结果各峰之间均分离良好(R>2),而4种目标溶剂峰的理论塔板数均大于100 000。见图2。

2.5 检测限与定量限的测定 将对照品储备液逐级稀释,按上述色谱条件顶空进样,测得甲醇、乙醇、苯、吡啶的检测限(S/N=3)分别为2.08,1.23,0.28, 0.87 μg·g-1;定量限(S/N=10)分别为9.17,4.18, 0.84,2.95 μg·g-1。

2.6 线性关系考察 将对照品储备液逐级稀释,各加入正丙醇内标储备溶液。按上述色谱条件分别进样,记录色谱图。以目标溶剂的浓度为横坐标,各目标溶剂峰与内标峰的峰面积比为纵坐标作线性回归,得回归方程,见表1。

2.7 精密度考察 取对照品溶液,连续进样5次,测得甲醇、乙醇、苯、吡啶与内标物正丙醇峰面积比的RSD分别为3.5%,2.0%,5.5%,1.8%。

2.8 加样回收率实验 精密称取已测得有机溶剂残留量的环戊丙酸睾丸酮供试品约0.30 g,置于顶空瓶中,分别加入低、中、高浓度的对照品溶液200 μL,各3份,按上述色谱条件分别进样,记录色谱图。根据内标法计算溶剂浓度而得到回收率,结果见表2。

A.HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm);B.AT.SE-30(30 m×0.25 mm,0.25 μm);C.AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm);D.AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm);E.DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);1.甲醇;2.乙醇;3.苯;4.吡啶图1 5种毛细管柱色谱图A.HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm);B.AT.SE-30(30 m×0.25 mm,0.25 μm);C.AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm);D.AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm);E.DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);1.methanol;2.ethanol;3.benzene;4.pyridineinFig.1 Chromatograum of five kinds of capillary column

1.甲醇(2.698 min);2.乙醇(2.831 min);3.苯(2.918 min);4.正丙醇(3.379 min);5.吡啶(4.599 min)图2 系统适用性测试1.methanol(2.698 min);2.ethanol(2.831 min);3.benzene (2.918 min);4.n-propanol(3.379 min);5.pyridinein(4.599 min)Fig.2 System suitability test

表1 4种溶剂回归方程及线性Tab.1 Linear regression and range of four solutions

2.9 供试品的测定 精密称取环戊丙酸睾丸酮约为0.30 g,置顶空瓶内,并加入正丙醇内标溶液200 μL,密封。按上述顶空色谱条件进行测定,采用内标法计算样品中各溶剂残留量,结果甲醇、乙醇含量均远低于《中华人民共和国药典》2010年版二部残留溶剂限度(0.3%,0.5%),含量分别为29.6,20.2 μg·g-1,未检出苯及吡啶,均符合ICH建议的限度。

表2 加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 本实验曾选择不同极性及不同口径的毛细管色谱柱,经多次实验采用DB-WAX柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),可使几种残留溶剂色谱峰峰形对称,分离度达到要求,同时能满足检测要求[3]。处理样品时为了避免样品分解,温度设置不宜过高,参考文献[4-6]并经实验,选择初温75℃,保留3 min,以30℃·min-1升至130℃,保留2 min。效果理想。

3.2 顶空样品量的选择 样品量是指顶空样品瓶中的样品体积[7]。实验使用碳酸钙固体模拟环戊丙酸睾丸酮样品,考察基质效应。经实验确定碳酸钙0.30 g时,苯响应值最大,且重复性好。

[1] 周海钧,陈振声,郑竹莲,等.药品注册的国际技术要求(质量部分)[M].北京:人民卫生出版社,2000:79-100.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录61-附录65.

[3] 刘虎威.气相色谱方法及应用[M].北京:化学工业出版社,2007:141-148.

[4] 张宇,韩锐.气相色谱法测定氨苄西林钠舒巴坦钠中残留溶剂吡啶方法研究[J].黑龙江科技信息,2010,(5):209-209.

[5] 王英瑛,李俊.顶空气相色谱法测定克林霉素磷酸酯中有机溶剂残留量[J].中国药业,2009,18(14):41.

[6] 邢俊波,乌宁奇,曹红,等.顶空毛细管气相色谱法测定麦志胶囊中有机溶剂残留量[J].中国中医药信息杂志, 2012,19(7):54-55.

[7] 张军,车海先.浅议顶空气相色谱[J].食品安全导刊, 2012,(5):48.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.027

Determination of Organic Solvent Residues in Testosterone Cypionate

JIANG Yi,CHEN Jing-jing,TIAN Feng,YANG Min
(College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo establish a headspace GC method for the determination of residual organic solvents in testosterone cypionate.MethodsThe residual organic solvents were determined by GC with DB-WAX capillary colum(30 m× 0.32 mm,0.25 μm)and FID detector at 230℃,using high purity nitrogen as the carrier gas by headspace sampling.The flow rate was 1.5 mL·min-1,the split ratio was 20∶1,the temperature of injection port was 220℃,the headspace heating temperature was 70℃,and the headspace balance time was 40 mins.The content of residues was calculated by using n-propanol as the internal standard.ResultsFour residual solvents were completely separated.There were good linearity for m-ethanol,ethanol,benzene and pyridinein in the ranges of 4.17-2.50×103μg·g-1(R=0.999 9),4.18-2.51×103μg·g-1(r=0.999 6),0.84-172 μg·g-1(r=0.998 1),and 2.95-1.77×103μg·g-1(r=0.999 9),respectively.The detection limit was 2.08,1.23,0.28,and 0.87 μg·g-1,respectively.The average recovery of methanol,ethanol,benzene and pyridinein was 102.2%(RSD=4.0%),99.6% (RSD=1.9%),112.6(RSD=5.6%),and 98.9%(RSD=1.6%),respectively.ConclusionThis method is reliable,sensitive, accurate and can be used for the determination of residual organic solvents in testosterone cypionate.

Testosterone cypionate;Residual organic solvents;Head-space capillary gas chromatography

R977.1;R927.2

A

1004-0781(2014)11-1499-03

2013-11-15

2013-12-20

蒋燚(1988-),女,湖北武汉人,在读硕士,研究方向:药物分析方法的研究与设计。E-maiI:jyjy0616@163. com。

杨敏(1963-),男,湖北武汉人,副教授,硕士生导师,研究方向:药物分析分析方法的研究与设计。E-mail:yimufu@263.net。