固相萃取偶联液相色谱质谱联用法测定鹿血中睾丸酮的含量

胡春兰 陈媛媛 王春民 任贵奇▲

1.颈复康药业集团有限公司，河北承德 067000；2.河北省中药新辅料技术创新中心，河北承德 067000

鹿血系鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon）和马鹿（Cervus elaphus）的血液，具有养血益精、行血祛瘀、消肿等功效。因其资源稀缺，所以“以次充好、假冒伪劣”等现象时有发生[1-5]。睾丸酮作为鹿血中的有效成分之一，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。通过测定鹿血中的睾丸酮含量，能在一定程度上评价鹿血的品质[6]。由于鹿血中甾体类化合物的研究比较少，作为甾体类化合物的睾丸酮分离、结构鉴定仅限于使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]。但是HPLC测灵敏度低，抗干扰能力差，易出现假阳性。液相色谱-质谱联用法具有定性能力强，检测限低等优点[9-12]，其能够利用四级杆检测器克服基质干扰，有更好的分辨率、更高的灵敏度、具有很强的定性定量能力[13-14]。有效的样品前处理对于定性定量分析的准确性至关重要，固相萃取作为前处理方法，具有便捷、高效等优点[15-16]。本实验采用两步提取、两步萃取的方法提取和净化鹿血中的睾丸酮，旨在建立液相色谱-质谱联用法测定睾丸酮的含量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Triple-TOF 4600 液质联用质谱仪（AB SCIEX）；Centrifuge 5424 离心机（Eppendorf）；12 孔固相萃取仪（CNW Technologies GmbH）；RE-5286A 旋转蒸发仪（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋仪（IKA）；0.22 μm 微孔滤膜（Sartorius Stedim Biotech GmbH）。

1.2 材料

鹿血（批号：B1501、B1502、B1503、B1504，采集自河北省承德市承德县鹿养殖场梅花鹿，鹿血样品符合《鹿副产品》[17]中关于鹿血的各项质量标准要求）；氮气（工业氮，承德燕山气体有限公司）；乙腈、提取甲醇、正己烷、乙酸乙酯（天津欧博凯化工有限公司）；液质甲醇（美国Fisher 公司）；水（屈臣氏饮用水）；睾丸酮对照品（批号：KBBCT12；CAS：58-22-0；98%北京伊诺凯科技有限公司）；SAX SPE 柱（最大上样量：500 mg，体积：3 mL，Part No.：63404，DIKMA）；Florisil SPE 柱（最大上样量：500 mg，体积：3 mL，Part No.：65004，DIKMA）。

2 方法与结果

2.1 HPLC 条件与质谱条件

HPLC 色谱柱：shim-Pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；柱温：40℃；流速：0.3 mL/min；进样量：20 μL；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脱（0～1 min，10%A；1～6 min，10%A→90%A；6～10 min，90%A；10～10.1 min，90%A→10%A；10.1～15 min，10%A）。

质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；正离子扫面；多重反应检测（multiple reaction detection，MRM）；去簇电压（de-clustering voltage，DP）为60.0 V；碰撞能（collision energy，CE）为10.0 eV。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品制备方法 取120 mL 的批号B1501 鹿血，加入80 mL 乙腈，超声20 min（功率150 W，频率40 kHz），离心2 min（3800 r/min，离心半径8.4 cm），取上清液，重复提取两次；提取液减压浓缩至近干，加入10 mL NaCl 溶液（0.25 g/mL）。50 mL 乙酸乙酯萃取，重复萃取3 次，合并萃取液，减压浓缩至近干；加5 mL 甲醇溶解，导入离心管A 中，加入5 mL 水，待过柱净化。

SAX 固相萃取柱以2 mL 甲醇、2 mL 50%甲醇溶液依次活化平衡，离心管A 中样品上柱，离心管A 用2 mL 50%甲醇溶液洗涤后上柱，合并滤液导入离心管B。离心管B 中样品50℃水浴并用氮气吹至无醇味。加3 mL 正己烷，涡旋，静置，取上清液，重复3 次，合并萃取液至离心管C。Florisil 固相萃取柱以4 mL乙酸乙酯，4 mL 正己烷依次活化平衡，离心管C 中萃取液过柱，流速不超过2 滴/s，离心管C 用2 mL 乙酸乙酯-正己烷（10∶90，V/V）洗涤后上柱，弃洗脱液。用4 mL 乙酸乙酯-正己烷（60∶40，V/V）洗脱柱子，重复两次。洗脱液导入离心管D，50℃水浴并用氮气吹至干。用1 mL 50%甲醇溶解，过0.22 μm 微孔滤膜得供试品溶液。所得图谱见图1、2。

图1 B1501 批鹿血样品中睾丸酮的二级扫描色谱图

2.2.2 对照品制备方法 取睾丸酮对照品适量，精密称定，置1.5 mL 离心管中，加1 mL 甲醇，摇匀，作为母液，精密量取100 μL 母液，置1.5 mL 离心管中，加900 μL 甲醇，制成浓度为30.33 μg/mL 的对照品储备液。所得图谱见图3、4。

图3 睾丸酮对照品的二级扫描色谱图

图2 B1501 批鹿血样品中睾丸酮质谱图

图4 睾丸酮对照品的质谱图

2.3 线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下的睾丸酮储备液，甲醇定容，制成浓度分别为1.5165×10-4、3.033×10-4、1.5165×10-3、3.033×10-3、1.5165×10-2、3.033×10-2、1.5165×10-1、3.033×10-1μg/mL 溶液，按照“2.1”项下条件下进样，97.06 和109.06 两个子离子中，子离子109.06 的响应值略大，更稳定，所以选做定量子离子。计算定量子离子109.06 的峰面积。

子离子109.06 的峰面积（Y）和浓度（X）的线性关系为：Y=145 051X+2694.6，R=0.9995。

定量子离子109.06 的R 值>0.999，表明睾丸酮在1.5165×10-4～3.033×10-1μg/mL 浓度范围内，线性关系良好。

2.4 精密度考察

取1.5165×10-1μg/mL 浓度的睾丸酮对照品在“2.1”条件下连续进样6 次。109.06（子离子）*和97.06（子离子）峰面积的RSD值分别为4.07%、4.12%，RSD<15%，提示仪器精密度良好（*是定量子离子）。

2.5 重复性考察

按“2.2.1”项制备的供试品溶液，重复实验6 次，按照“2.1”条件下分别进样。109.06（子离子）*和97.06（子离子）峰面积的RSD值分别为13.71%、13.14%，RSD<15%，提示重复性良好。

2.6 稳定性考察

取120 mL 批号B1501 的鹿血，按“2.2.1”项制备供试品溶液，分别在0.5、1、2、4、6、24 h 时间按照“2.1”条件进样。109.06（子离子）* 和97.06（子离子）峰面积的RSD值分别为7.90%、9.40%，RSD<15%，提示供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率考察

采用加样回收法，精密量取120 mL 批号B1501的鹿血（109.06 子离子测得含睾丸酮浓度为3.32×10-4μg/mL，睾丸酮含量为4.0×10-2μg），加入1 mL浓度为4.033×10-2μg/mL 的睾丸酮对照品，混匀。按“2.2.1”项制备供试品溶液，进行6 次，按照“2.1”项下条件进样，测定109.06 子离子的峰面积，分别计算子离子的平均回收率和RSD值，结果见表1。结果显示，本研究中，以109.06 为定量子离子的睾丸酮平均加样回收率为66.62%。由于在基质复杂、含量低于0.01%分析中，回收率标准可适当放宽，可以低于70%，符合2020 版《中华人民共和国药典》四部[18]的标准。

表1 以109.06 为定量子离子的睾丸酮加样回收率结果（n=6）

2.8 鹿血中睾丸酮的测定

B1501、B1502、B1503、B15044 个批次的鹿血，分别取120 mL，每批次平行实验4 次，按“2.2.1”项制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样，计算每个批次平均睾丸酮含量及RSD值，结果见表2。结果显示，四个批次鹿血中睾丸酮含量范围为3.30×10-4～3.48×10-4μg/mL，RSD均<3%。

表2 四个批次鹿血中睾丸酮的含量（n=4）

3 讨论

对本实验过程中所用的提取溶剂进行了考察。最初选用甲醇萃取鹿血中的睾丸酮，结果杂质较多，后用乙腈先沉淀蛋白，再用乙酸乙酯萃取其中睾丸酮。两步萃取不仅增加了实验的复杂程度，还增大了实验过程中睾丸酮样品的损失，降低了加样回收率。但是大大降低检测时杂质的影响，增加了实验检测数据的准确性。

对本实验过程中所用固相萃取柱的考察。主要考察了酸性氧化铝固相萃取柱、C18固相萃取柱、SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱。单一固相萃取柱不能降低基质效应，于是选用两种固相萃取柱联用法。通过文献得出[19-21]，酸性氧化铝固相萃取柱、C18固相萃取柱和SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱两种萃取柱组合方法。都能降低基质效应的前提下，采用回收率法优选两种萃取柱组合，SAX 固相萃取柱、Florisil 固相萃取柱组合优于酸性氧化铝固相萃取柱、C18固相萃取柱组合。

对本实验过程中所用的色谱溶剂进行了考察。从甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水两种色谱溶剂组合中优选，通过多次实验结果得出,甲醇-0.1%甲酸水色谱溶剂结果更稳定，得出的峰型相对更好。

对本实验质谱条件中的DP 和CE 值进行了优选。采用动态扫描优选DP 和CE 值。随着DP 和CE值的增大，子离子量增大，母离子量减小。选取子离子和母离子量合适时的DP 和CE 值。

睾丸酮作为鹿血改善性功能的主要有效成分[22]，测定其含量能评价鹿血的质量。单一检测鹿血中睾丸酮含量作为鹿血的质量评价条件，不能全面评价鹿血的质量，如果加入指纹图谱法能更全面的评价鹿血的优劣，这是本课题的下一步研究。

本实验通过固相萃取偶联液相色谱质谱联用法法测定鹿血中睾丸酮的含量，经方法学研究结果表明，该方法重复性好，稳定性高，回收率达标。综上所述，本研究建立方法的结果可靠，有效降低了基质效应，能够为更好地控制鹿血质量提供参考。