仙鹤延龄方抗肿瘤活性的计算药理学*

姜明,郑啓盛,于光允,龙伟,刘培勋

(中国医学科学院、北京协和医学院放射医学研究所,天津市放射医学与分子核医学重点实验室,天津 300192)

·药物研究·

仙鹤延龄方抗肿瘤活性的计算药理学*

姜明,郑啓盛,于光允,龙伟,刘培勋

(中国医学科学院、北京协和医学院放射医学研究所,天津市放射医学与分子核医学重点实验室,天津 300192)

目的 研究仙鹤延龄方抗肿瘤活性的分子机制。方法采用分子对接、生物网络技术、化学空间技术和药动学性质预测等计算药理学方法研究仙鹤延龄方中241个小分子化合物的作用机制。结果仙鹤延龄方大部分分子具有良好的类药性质;仙鹤延龄方中小分子在化学空间中的分布表明,该方中大部分活性分子具有相似活性,说明仙鹤延龄方组方科学;仙鹤延龄方中既存在一个分子与多个靶蛋白的相互作用,也存在不同分子作用于同一个蛋白的现象,例如靶点环氧化酶-2(COX-2)与40个小分子存在相互作用,分子儿茶素与COX-2等5个靶点存在相互作用。结论该结果有助于理解仙鹤延龄方抗肿瘤活性复杂的作用机制。

仙鹤延龄方;抗肿瘤;分子对接;生物网络;化学空间

仙鹤延龄方是由仙鹤草、白花蛇舌草、甘草和白英组成的具有抗肿瘤作用的临床经验方化裁而成,该方具有清热解毒、攻坚散结、祛瘀止痛功效,主治因气滞血瘀、痰凝毒聚而导致的各种实体瘤,对肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌等效果尤佳。笔者通过体外研究发现,仙鹤延龄方中总黄酮提取物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG-2)和人卵巢透明细胞癌细胞(ES-2)这3个肿瘤细胞系的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)分别为24.948,31.569和6.923 μg·mL-1,说明仙鹤延龄方中总黄酮对3个肿瘤细胞系都有较好的抑制效果。体内研究发现,仙鹤延龄方总黄酮对荷肝癌22(H-22)小鼠肿瘤生长有剂量依赖的抑制作用,当总黄酮给药剂量在60 mg·kg-1时,其对H-22的抑制率为72.09%[1]。笔者在本实验中尝试运用分子对接、生物网络技术和化学空间技术研究仙鹤延龄方化学成分与多个肿瘤相关靶点之间的相互作用,结合仙鹤延龄方中小分子吸收、分布、代谢、排泄和毒性(absorption,distribution,metabolism, excretion and toxicity,ADME/T)性质预测,以期研究仙鹤延龄方抗肿瘤物质基础,诠释其多靶点作用机制,为肿瘤治疗提供科学依据。

1 实验方法

1.1 中药小分子配体的准备 根据仙鹤延龄方药味组成,从中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库子库中药与有效成分数据库和Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Database中检索仙鹤草、白花蛇舌草、甘草和白英化学成分,通过文献调研对数据进行补缺[2],并附加每个化学成分已有的生物活性数据,建立化学分子数据库,该数据库以SDF格式呈现,小分子配体共计241个,其中黄酮类分子106个。在Schrodinger软件Maestro平台上搭建小分子分子模型,应用Ligprep对每个小分子配体进行相关处理,选择OPLS_2005力场进行结构优化。

1.2 蛋白质靶点的准备 通过文献调研,选取15个与肿瘤相关的酶和受体作为研究靶点,包括表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、周期蛋白依赖性蛋白激酶2(cyclin-dependent protein kinases 2,CDK2)、局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、法尼基转移酶(farnesyl transferase,FTase)、环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、凋亡抑制基因(B-Cell Lymphoma-extra large,BCL-xl)、P38、细胞外信号调节激酶2(extracellular signal regulated kinase 2,ERK2)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactived protein kinase,MEK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、整合素(integrin α5β3)、核因子-κB抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta,IKK2)。在结构生物信息学研究室(the research collaboratory for structural bioinformatics,RSCB)蛋白质数据库中搜索以上15个靶点对应的蛋白质,得到晶体结构(表1)。

1.3 分子对接过程

1.3.1 靶点的准备 使用Schrödinger中蛋白质蛋白准备模块Protein Preparation Wizard对靶点蛋白进行处理、加氢、调整键序,选用OPLS_2005进行能量最小化处理至均方根偏差(root-mean-square deviation, RMSD)为0.3 nm,以减少蛋白质空间结构冲突,对蛋白质进行相关处理和结构优化;应用Glide模块Receptor grid generation面板生成活性口袋,具体参数设置为:以蛋白晶体中的原配体为中心生成格点,蛋白和配体间Coulomb-van der Waals(vdW)范围设定为1.0/0.8。由于FTase活性口袋中含有金属锌离子(Zn2+),且Zn2+与配体的相互作用对于酶活性抑制有着显著的相关作用,所以在形成格点时要加以限制,其他操作与上述步骤相同。

表1 与肿瘤相关的蛋白Tab.1 Tumor-related protein

1.3.2 分子对接与打分 采用Glide/Ligand Docking将准备好的仙鹤延龄方中的小分子配体与上述处理好的15个靶点进行分子对接,选择标准精度(standard precision,SP),柔性对接,以对接评分G-Score来评价分子与靶点之间的相互作用,G-Score分值越低,表明分子与靶点相互作用越强。仙鹤延龄方中小分子配体与靶点对接完后,采用Ligprep对靶点蛋白质晶体中原配体进行处理,然后分别与15个靶点进行对接,得到的对接评分G-Score作为参照,用于评价仙鹤延龄方中小分子配体与靶点的对接结果。

1.4 分子靶蛋白网络的构建 根据分子对接计算结果,以靶蛋白复合物中的原配体对接分数为阈值,打分高于此阈值的小分子即认为具有活性,再从中抽取较高得分(G-Score≥8)的分子与靶蛋白导入Cytoscape 3.0.1版网络分析软件[3],构建仙鹤延龄方分子与靶蛋白作用网络,其中分子、靶蛋白用节点(node)表示,边(edge)表示分子与靶蛋白间的相互关系,某个分子与某个靶蛋白存在相互作用,则它们就会通过edge连接起来,之后进一步通过Cytoscape软件中的network analyzer插件分析网络特征:网络度(degree)、网络密度(network density)、最短路径等,预测仙鹤延龄方可能的活性分子群、潜在靶蛋白等。

1.5 仙鹤延龄方化学空间的构建与分析

1.5.1 描述符计算 基于仙鹤延龄方小分子化合物与靶蛋白的对接结果,构建仙鹤延龄方化学空间。把15个靶点每一个靶点看作一个描述符,每一个描述符作为一个维度,所有的小分子化合物分布在一个多维化学空间。

1.5.2 化学空间降维 将小分子241个与靶蛋白15个的对接打分G-Score数值导入SPSS13.0版数据分析软件中,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法,对15个描述通过相关矩阵、对角化得到特征值和特征向量,用特征向量矩阵作为一个变换矩阵变换数据把大部分信息代进相关。

对矩阵新成分中的3个成分进行作图,从而将多维描述符的数据有效地映射到三维图上,最后选出的3个主成分累积贡献率达到80%,说明前3个主成分基本包含了全部指标具有的信息。由此形成仙鹤延龄方的三维化学空间。

1.6 药动学特征预测 根据“Lipinskis rule of five”规则,分析仙鹤延龄方中分子的类药性质。采用Discovery Studio 2.5中的ADME/T模块,分析仙鹤延龄方中所含分子的相对分子质量、氢键受体、氢键供体、脂水分配系数,并计算肝毒性、人细胞色素P4502D6酶结合、被动的肠内吸收性、25℃下水溶性性质,初步分析仙鹤延龄方药动学性质。

2 结果

2.1 仙鹤延龄方所含小分子与靶蛋白相互作用 虚拟筛选结果显示,仙鹤延龄方中136个分子和15个靶点有较好作用,说明仙鹤延龄方中存在多种能防治肿瘤的有效小分子化合物,显示仙鹤延龄方多活性化合物多靶点作用特点。在上述136个有效分子中,有69个分子属于黄酮类分子,说明仙鹤延龄方中黄酮类分子具有很好的抗肿瘤活性,也和本实验室之前的结果相对应。

为进一步阐明复方中化合物与靶点的作用情况,笔者对筛选出来的活性分子采用Cytoscape软件网络分析技术,做出复方分子与靶蛋白的网络分布图(图1)。从图1中可以更加形象地看出,复方中既存在一个分子与多个靶蛋白的相互作用,也存在不同分子作用于同一个蛋白的现象,这符合中药作用特点。利用Cytoscape自带的network analyzer插件分析仙鹤延龄方分子靶蛋白作用网络,得到重要参数统计结果(表2)。网络中节点的度值代表与该节点相连的边的数量[4]。节点度值越大,表明节点在网络中越重要[5]。通过分析靶蛋白和小分子化合物节点度值预测仙鹤延龄方抗肿瘤活性的可能作用机制。

肿瘤发生和发展是一个复杂的病理过程,受到多种因素的调节。其中,新血管生成和肿瘤炎症反应已经被认为是肿瘤的两个标志[6-7]。从靶蛋白的节点分析,iNOS、COX-2、P38和VEGF的度值较大,说明仙鹤延龄方能协同作用于这几个靶点,表明仙鹤延龄方可能通过抑制肿瘤炎症反应和血管生成等发挥抗肿瘤活性。

从化合物的节点分析,仙鹤延龄方中有56个分子与≥3个靶点存在较好的相互作用,表3中显示的是度值较大的节点分子。例如仙鹤草中儿茶素与COX-2、iNOS、JNK、VEGF、P38这5个靶蛋白存在较强的相互作用;甘草中的新西兰牡荆苷与COX-2、CDK-2、JNK、ERK、EGFR和VEGFR等6个靶蛋白产生较强的相互作用;甘草中的异槲皮苷对iNOS、CKD2、JNK、ERK、IKK2、EGFR、VEGFR等7个靶点都有较好的相互作用。已有文献报道,儿茶素能作用于COX-2、iNOS、VEGF等靶点,发挥抗炎抗肿瘤作用[8-9];新西兰牡荆苷能作用于COX-2、EGFR等靶蛋白,具有良好的抗肿瘤活性[10-11];异槲皮苷能作用于JNK、EGFR等蛋白质靶点,从而发挥抗肿瘤作用[12-13],这与本实验结果相符合。已有研究发现,芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-葡萄糖苷等分子具有良好的抗肿瘤活性[14-15]。这些分子都属于黄酮类分子,既与本实验室之前的研究相符,也说明仙鹤延龄方中含有多种抗肿瘤活性良好的小分子化合物。

一些分子如山奈酚-7-O-鼠李糖苷(图2A),从其节点度值可知具有良好的抗肿瘤潜质。目前关于山奈酚-7-O-鼠李糖苷的抗肿瘤活性,笔者尚未见报道,但已有大量文献报道其母核结构山奈酚(图2B)具有良好的抗肿瘤活性[16-17]。一些糖苷类天然产物往往需要在体内代谢,糖苷键断裂,释放出母核结构而发挥生物学活性。这也提示,山奈酚-7-O-鼠李糖苷这类化合物可能具有抗肿瘤活性,值得深入研究。

2.2 仙鹤延龄方化学空间构建与分析 化学空间是通过一系列特定选择的描述符描述化合物性质形成的多维描述符空间[18]。化学空间技术对于中药复方这种复杂体系的宏观描述具有一定优势,它能够从可视的角度展现中药复方在化学意义上的定位与功能。笔者借助化学空间的手段,可以观察到一个中药复方的整体化学性质与功能趋向,从而指导推进中药复方在现代药理学意义上的重新定义与功能延展。

EGFR:表皮生长因子受体;VEGFR:血管内皮生长因子受体;VEGF:血管内皮生长因子;CDK2:周期蛋白依赖性蛋白激酶2; FAK:局部黏着斑激酶;FTase:法尼基转移酶;COX-2:环氧合酶2;iNOS:诱导性一氧化氮合酶;BCL-xl:凋亡抑制基因;ERK2:胞外信号调节激酶;MEK:丝裂原活化蛋白激酶;JNK:c-Jun氨基末端激酶;integrin α5β3:整合素;IKK2:核因子-κB抑制剂图1 仙鹤延龄方化合物-靶点相互作用网络EGFR:epithelial growth factor receptor;VEGFR:vascular endothelial growth factor receptor;VEGF:vascular endothelial growth factor; CDK2:cyclin-dependent protein kinases 2;FAK:focal adhesion kinase;FTase:farnesyl transferase;COX-2:cyclooxygenase 2;iNOS: inducible nitric oxide synthase;BCL-xl:B-Cell Lymphoma-extra large;ERK2:extracellular signal regulated kinase 2;MEK:mitogenactived protein kinase;JNK:c-Jun N-terminal kinase;integrin α5β3:integrin α5β3;IKK2:Inhibitor of Nuclear Factor kappa-B kinase subunitbetaFig.1 Xianhe yanling recipe compound-target interaction network

表2 仙鹤延龄方化合物-靶点相互作用网络的参数Tab.2 Parameters of xianhe yanling recipe compoundstarget interaction network

笔者在本实验中利用化学空间技术,把15个靶点中的每个靶作为一个描述符,每个描述符作为维度,构建仙鹤延龄方所含的241个小分子化合物的化学空间。在此化学空间中,功能相近的化学实体在一定的化学空间中往往存在分类聚集的趋向,而彼此有联系的对象也常常在化学空间通过空间分布状态表现出这种联系。利用PCA对构建的多维空间进行降维处理,得到主成分1(PC1)-主成分2(PC2)-主成分3(PC3)的三维空间分布,PC1、PC2和PC3的累积贡献率达到81.004%,见图3。从仙鹤延龄方的化学空间图中可以发现,复方中各个分子在化学空间中的分布有疏有密,但有相当大一部分分子聚集在化学空间的特定区域,说明仙鹤延龄方中包含相当一部分作用机制相似的抗肿瘤活性分子,这与虚拟筛选结果相符,也说明仙鹤延龄方组方科学。

2.3 仙鹤延龄方的药动学性质初步分析 根据“rule of five”规则[19],口服药物的描述符具有以下特点:相对分子质量(relative molecular mass)＜500,氢键给体数目(number of H bond donors)＜5,氢键受体数目(number of H bond receptors)＜10,脂水分配系数(AlogP98)＜5。如果违反过多,则药物的溶解性和肠吸收能力会受到限制。从表4中各分子描述符的平均值及其中位数可知,仙鹤延龄方含有的化合物中,平均相对分子质量477.06,中值416.64;氢键给体数目平均值4.53,中值4;氢键受体数目平均值8.21,中值6;脂水分配系数平均值3.02,中值3.14;说明仙鹤延龄方含有的化合物具有较好的类药性质。

A.山奈酚-7-O-鼠李糖苷;B.山奈酚图2 山奈酚-7-O-鼠李糖苷和山奈酚的结构A.structure of kaempferol-7-O-rhamnoside and picture;B.structure of kaempferolFig.2 Structures of kaempferol-7-O-rhamnoside and kaempferol

表3 仙鹤延龄方化合物-靶点相互作用网络中部分节点的度值Tab.3 Part degree value of nodes in XHYLR compounds-targets interaction networks

图3 仙鹤延龄方的化学空间Fig.3 Chemical space of xianhe yanling recipe

药动学特征预测结果显示,70.12%的化合物有可以接受的水溶性,63.49%的化合物肠吸收性良好。水溶性和肠吸收说明仙鹤延龄方作为口服制剂合理。但预测的肝毒性和细胞色素P450(cytochrome)2D6酶抑制药结果与临床试验不一致。可能与仙鹤延龄方中的有毒化合物含量低,人体二次代谢及配伍后药物溶解度增加,从而起到增效减毒作用等有关。

3 讨论

从分子对接结果和仙鹤延龄方分子-靶点网络可以看出,仙鹤延龄方中的小分子化合物既存在能作用于多个靶点的分子,也存在多个分子作用于一个靶点的现象,说明仙鹤延龄方具有良好的抗肿瘤活性,也体现了中药多层次、多途径、多靶点效应。仙鹤延龄方中分子在化学空间中特定区域内大量聚集,说明仙鹤延龄方中含有大量功能相似的小分子化合物。利用功能相似的化合物治疗疾病也符合用药的特点,也说明仙鹤延龄方组方科学。综上所述,本实验在一定程度为仙鹤延龄方的抗肿瘤作用机制提供了相应的科学阐述,而对筛选到的可能具有良好抗肿瘤活性的小分子化合物的活性验证,是笔者下一步需要进行的工作。

表4 仙鹤延龄方中241个分子的主要分子描述符Tab.4 Key molecular descriptors of 241 compounds in Xianhe yanling recipe

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.001

Computational Pharmacology of Xianhe Yanling Recipe in Anti-tumor Activity

JIANG Ming,ZHENG Qi-sheng,YU Guang-yun,LONG Wei,LIU Pei-xun
(Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecula Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China)

ObjectiveTo explore the antitumor mechanism ofxianhe yanlingrecipe(XHYLR).MethodsThe mechanism of action of 241 compounds contained in the Chinese medicine,XHYLR was studied by using computational pharmacological.Methods including molecular docking,biotechnology network,chemical space technology and the prediction of absorption,distribution,metabolism,excretion and toxicity(ADME/T).ResultsMost of the compounds in XHYLR had good drug-like properties.Distribution of 241 compounds in chemical space also revealed that these compounds showed similar anti-tumor activity.It suggested that the prescription of XHYLR was reasonable.The phenomena that one molecular interacted with multiple target proteins and several molecules interact with one target protein were observed in XHYLR.For example,the COX-2 interacted with 40 micromolecules,and catechin interacted with five targets including COX-2.ConclusionThese results are helpful for understanding the complicated mechanism of anti-tumor activity of XHYLR.

Xianhe yanlingrecipe;Anti-tumor;Molecular docking;Network;Chemical space

R282;R285;R965

A

1004-0781(2014)11-1401-06

2013-11-17

2013-12-25

*国家自然科学基金资助项目(81202153);协和青年基金与中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(3332013104,3332013008);教育部博士点新教师基金资助项目(20121106120042)

姜明(1990-),男,江西南昌人,硕士,研究方向:药物化学。E-mail:jiangmingpumc@126.com。

龙伟(1979-),男,湖南益阳人,助理研究员,研究方向:中药化学和创新药物研究。电话:022-85683042,E-mail:longwaylong@gmail.com。

刘培勋(1954-),男,山西忻州人,研究员,研究方向:中药化学和创新药物研究。电话:022-85683042,E-mail:liupeixun@ irm-cams.ac.cn。