淫羊藿苷通过降低醛固酮水平减轻自发性高血压大鼠肾间质纤维化

李叶丽，王颖婉，李意奇，张丽梅，龚其海，杨丹莉

高血压肾损害系由原发性或继发性高血压引起的肾脏疾病，其中肾间质纤维化是导致肾脏损伤的重要原因。醛固酮作为肾间质纤维化进程中的一个重要因素，已成为高血压肾损害研究的热点之一。最近研究表明，醛固酮可上调离体的肾小管上皮细胞促纤维化的细胞因子如Ⅲ型胶原、TGF-β1、CTGF、FN等的表达［1－4］，加速肾间质纤维化的发生与发展。淫羊藿为小檗科淫羊属植物，具有温阳补肾、除风祛湿、强心益气等功效。ICA是淫羊藿的主要活性成分，现代药理学研究证明，ICA具有抗肿瘤、增强免疫、改善心脑血管功能、调节内分泌及抗骨质疏松等作用［5］。本研究拟观察 ICA是否具有抗SHR肾间质纤维化作用，及该效应是否与降低醛固酮水平，下调TGF-β1和Smad2的表达有关。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 淫羊藿苷购自南京泽朗医药有限公司；醛固酮试剂盒和Ⅲ型胶原试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；RNA逆转录试剂盒、荧光混合物，β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN的引物购自TaKaRa生物工程公司；RNA逆转录仪，德国Eppendorf公司；real time RT-PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司；通用酶标仪，美国 BIO-RAD公司；Leica光学显微镜及照相系统，德国Leica Microsystems Ltd。

1.2 实验动物及分组 13周龄的♂ SHR大鼠14只、WKY大鼠7只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012－0001。SHR大鼠随机分为两组，分别为模型组（n＝7）和ICA组（n＝7），WKY大鼠作为对照组。所有大鼠适应性饲养1周后，ICA组给予 ICA 40 mg·kg－1，ig，bid，至26周龄，模型组和对照组给予等量生理盐水。

1.3 肾脏病理学 给药14周后，7%水合氯醛（0.35 g·kg－1）经腹腔注射麻醉成功后，取各组大鼠肾脏组织，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，分别进行HE和Masson染色，光镜下观察肾脏病理学变化。

1.4 血浆醛固酮和Ⅲ型胶原含量测定 腹主动脉取血2 ml，置于抗凝管中，离心后取上清，采用双抗体夹心法测定血浆醛固酮和Ⅲ型胶原含量。测定方法严格按照试剂盒说明书执行。

1.5 real time RT-PCR法检测肾脏组织中TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达 取各组肾脏组织，置于1 ml TRIzol中，提取总RNA并检测其纯度后，经两步法逆转录－聚合酶链反应分别检测β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达。相关引物参照 GenBank中大鼠 β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的序列设计，见 Tab 1。目的基因表达相对定量法：以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需的循环数（cycle threshold，Ct值）为统计参数，依次计算平均 Ct值 ＝（Ct1＋Ct2）／2（重复管）；dCt＝平均 Ct值 －中间值；基因表达 ＝2－dCt；相对定量 ＝目的基因的表达／内参基因的表达×100，将空白对照组的mRNA表达量设定为100。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS 11.0统计分析软件进行处理，以¯x±s表示，组间比较采用方差分析，SNK法两两比较。

2 结果

2.1 肾脏病理学 HE和Masson染色均显示对照组肾小球、肾小管结构正常。与正常对照组比较，HE染色结果显示模型组肾小球囊腔狭窄且不规则，小球内系膜基质增多，细胞排列紊乱，Masson染色结果显示肾小管纤维增生，间质纤维化；与模型组比较，HE和Masson染色显示ICA组肾小球囊腔增宽，小球内系膜基质减少，细胞排列较为整齐，肾小管间质纤维化程度减轻，见Fig 1。

2.2 血浆醛固酮和Ⅲ型胶原含量 与正常对照组比较，模型组血浆醛固酮和Ⅲ型胶原含量均升高（P＜0.01）；与模型组比较，ICA组血浆醛固酮和Ⅲ型胶原含量均降低（P＜0.01或 P＜0.05），结果见Tab 2。

Tab 1 Primer pair of real time RT-PCR

Tab 2 Effects of ICA on plasma aldosterone and collagen typeⅢ（¯x±s，n＝6）

2.3 肾脏组织中 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达 与正常对照组比较，模型组TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达均明显上调（P＜0.01或 P＜0.05）；与模型组比较，ICA组 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达均明显下调（P＜0.01或P＜0.05），结果见Fig 2。

3 讨论

肾间质纤维化是肾脏疾病发展和预后的重要因素，也是导致肾单位进行性损伤的病理机制，其本质是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常沉积，ECM过度合成和降解受抑是ECM积聚的直接原因［6］。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组肾小球囊腔狭窄且不规则，肾小球内系膜基质增多，肾小管间质纤维化，提示模型组大鼠出现了明显的肾间质纤维化。另有研究表明［7］，24周龄的自发性高血压大鼠出现了明显的肾间质纤维化。

Fig 1 HE staining of kidney tissue（×400）and Masson staining of kidney tissue（×200）

Fig 2 Effects of ICA on expressions of TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA in kidney tissue（¯x±s，n＝6）

醛固酮可促进肾间质纤维化的发生［8－9］，也可上调Ⅲ型胶原、TGF-β1、CTGF、FN等的表达［1－4］。最近研究表明，醛固酮可能通过调控基质金属蛋白酶1／金属蛋白酶1组织抑制剂（MMP-1／TIMP-1）的基因表达，使Ⅲ型胶原降解减少，ECM过度积聚［3］；也可能通过促进 TGF-β1的表达诱导CTGF的表达［10］，从而促进肾间质纤维化的发展。

TGF-β1是一种重要的促纤维化细胞因子，可参与成纤维细胞的增殖、分化与迁移，促进ECM的生成与沉积，抑制其降解［11］。TGF-β1／Smad2信号通路的过度激活，可导致肾脏ECM生成增多，直接或间接导致CTGF和FN的产生［12］。CTGF作为TGF-β1的下游，可促使TGF-β1发挥促增生和ECM合成等作用［13］，也可在 TGF-β1诱导下参与成纤维细胞合成FN，使ECM在肾间质积聚，促进肾间质纤维化的发展。

与模型组相比，ICA组肾小球囊腔增宽，肾小球内系膜基质减少，细胞排列较为整齐，肾小管间质纤维化程度减轻，提示ICA可能具有抗SHR肾间质纤维化的作用。此外，ICA组血浆醛固酮、Ⅲ型胶原含量，以及 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表达均明显低于模型组，提示ICA可能通过降低醛固酮水平，下调TGF-β1和Smad2的表达抗SHR肾间质纤维化。

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