四氢生物蝶呤在2型糖尿病肾病小鼠肾脏NO生成中的作用

汪建云，王栋栋，陆昭磊，朱 闯，张 帆，郭 昊，印晓星

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是导致终末期肾病的常见病因之一，严重影响了糖尿病患者的生活质量。在DN的发生发展过程中，一氧化氮（nitric oxide，NO）发挥着重要的作用，直接参与了糖尿病早期肾小球高灌注和高滤过的形成，造成DN的多尿与蛋白尿［1－2］。我们前期的实验发现，高糖培养的肾小球系膜细胞诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）活性明显增高，进而引起NO增高［3］。四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）为NO合成的关键酶iNOS的必要辅因子，NO的生成与BH4的水平有着密切的联系。目前有关糖尿病肾病中BH4与NO及尿量、蛋白尿关系的研究，鲜见报道。

本研究采用BH4合成酶－Ⅰ型三磷酸鸟苷环化水解酶（guanosine triphosphate cyclohydrolase I，GTPCHⅠ）的抑制剂 2，4二氨基 6羟基嘧啶（DAHP），在国际上广为采用的先天性2型糖尿病所致的肾病模型（2型DN）db／db小鼠上，观察BH4对iNOS的蛋白表达、NO生成及血尿生化指标的影响，为2型DN的防治寻找新的靶点提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 尿蛋白检测试剂盒、NOS活性检测试剂盒及血肌酐（Scr）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，总NO试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，葡萄糖测定试剂购自上海荣盛生物药业有限公司。DAHP购自Sigma公司，兔多克隆抗iNOS抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处置 12周龄自发性糖尿病C57BL／KSJdb／db小鼠及同周龄非糖尿病C57／KSJ db／m小鼠，由南京军区总医院从美国Jackson公司引进，自体繁殖成功后提供。收集小鼠24 h尿液，检测24 h尿蛋白，证实小鼠发生DN（db／db小鼠24 h尿蛋白含量明显高于db／m小鼠）。将成模的DN小鼠随机分为2组：DAHP治疗组（DAHP组，n＝8），腹腔注射 DAHP150 mg·kg－1（溶于 5%DMSO生理盐水中）；糖尿病肾病组（DN组，n＝6），腹腔注射相同剂量的5%DMSO生理盐水。同周龄db／km小鼠为正常对照组（NS组，n＝6），腹腔注射相同剂量的5%DMSO生理盐水。所用的动物实验按照徐州医学院伦理委员会准则操作。3组小鼠给药7 d，收集血液及24 h尿液，处死。迅速分离两侧肾脏，生理盐水冲洗后称重，去除髓质。取部分肾皮质以福尔马林固定，作iNOS的免疫组化测定。其余肾皮质置于－80℃冰箱内，备BH4、NO及iNOS蛋白的检测。

1.2.2 常规血尿生化指标测定 血糖采用葡萄糖氧化酶法检测；用代谢笼收集小鼠24 h尿量，24 h尿蛋白测定采用考马斯亮蓝法检测；血肌酐采用苦味酸法检测。所有指标均在Elx808IU酶标仪上检测（美国Bio-tex公司）。

1.2.3 Griess法检测肾皮质NO 将50 mg肾皮质用200μl的PBS匀浆处理，离心。根据Griess反应原理，取100μl离心液加入等量的Griess反应液，混匀，室温放置10 min，用酶标仪于540 nm处进行光密度测定，根据标准曲线换算NO浓度。

1.2.4 比色法检测肾皮质iNOS活性 将50 mg肾皮质用200μl的PBS匀浆处理，离心，取上清液。iNOS的活性不依赖钙，可催化L-精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm波长处测定其光密度值，即代表iNOS活性。具体操作参照NOS活性检测试剂盒说明进行。

1.2.5 免疫组化法检测iNOS蛋白 大鼠肾脏以10%中性福尔马林固定24 h后，石蜡包埋切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%H2O237℃孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶，0.01 mol·L－1枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸15 min，以修复抗原，正常山羊血清工作液封闭2 h，滴加兔多克隆抗iNOS抗体（1∶200），4℃ 冰箱孵育过夜，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，DAB显色。

1.2.6 Western blot法测iNOS蛋白 取预处理的肾皮质细胞在冷提液中匀浆。以BCA法测定总蛋白浓度。取上样蛋白100μg，经8%的SDS-PAGE电转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。加兔多克隆抗iNOS抗体（1∶200），4℃过夜；TBST缓冲液洗膜后，加碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）孵育2 h。滴加 BCIP／NBT显色液，避光显色15 min。以β-actin为内参，iNOS与β-actin的灰度比值代表iNOS的相对表达量。

1.2.7 HPLC法检测BH4将肾皮质组织在裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol·L－1DTT，1 mmol·L－1EDTA）中匀浆、离心。取上清，BCA试剂盒检测蛋白含量。在上清中按照90μl裂解液中加入10μl 1.5 mol·L－1HClO4和2.0 mol·L－1H3PO4（1∶1）的比例处理析出蛋白，取上清分两部分处理。一部分在酸性条件下氧化：按90μl裂解液中加10μl 1% 碘液（2%KI配制）比例混匀，避光置于室温60 min，加入5μl新配制的抗坏血酸溶液（20 g·L－1），离心；一部分于碱性条件下氧化：按80μl裂解液中加入10μl NaOH，再加入10 μl碘液的比例混匀，避光置于室温60 min；加入20 μl H3PO4及5μl抗坏血酸溶液，离心。取两者的上清采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm柱）反相高效液相色谱法分析（Shimadzu LC.10A高效液相色谱仪，日本岛津）。以甲醇／水混合液（5% ∶95%）作为流动相，1.0 ml·min－1恒速洗脱。通过荧光检测器（RF-10Ax）在荧光激发波长350 nm、发射波长450 nm处检测生物蝶呤的积分峰面积值，出峰时间6.0 min左右。该方法检测生物蝶呤灵敏度为152 ng·L－1。在酸性条件下氧化的标本检测出总生物蝶呤（biopterin）包括BH4、二氢生物喋呤和生物喋呤；在碱性条件下氧化的标本检测出二氢生物喋呤和生物喋呤；将二氢生物喋呤和生物喋呤从总生物蝶呤中除去，就是BH4含量。

1.3 统计学分析 数据均以¯x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件处理。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。

2 结果

2.1 小鼠各项生化指标 DN组及DAHP组小鼠血糖、24 h尿蛋白、24 h尿量、Scr明显高于NS组（P＜0.05），表明db／db小鼠此时已进入DN阶段，DN模型建模成功。与DN组比较，DAHP组体重、24 h尿蛋白及尿量明显低于DN组（P＜0.05），而Scr及血糖无明显降低（Tab 1）。

Tab 1 Biochemical characteristics of mice（¯x±s）

2.2 各组小鼠肾皮质中BH4水平 DN组的BH4水平明显高于 NS组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明糖尿病肾病时肾皮质中BH4水平增高；BH4合成酶抑制剂DAHP组的BH4水平明显低于DN组（P＜0.01），表明DAHP能明显抑制糖尿病肾病时BH4的合成（Fig 1）。

Fig 1 BH 4 levels in renal cortex of mice

2.3 小鼠肾皮质中iNOS蛋白表达 免疫组化法显示：肾小球iNOS蛋白位于肾细胞胞质中。NS组肾皮质中iNOS蛋白鲜有表达，DN肾病中iNOS蛋白染色密度较NS组明显加深，经过DAHP治疗后，DN小鼠的肾皮质中iNOS蛋白染色密度降低。Western blot结果显示：DN组的iNOS蛋白水平明显高于NS组，差异有统计学意义（P＜0.01），DAHP组的iNOS水平明显低于DN组（P＜0.05）（Fig 2）。表明DN小鼠肾皮质中iNOS蛋白表达增高；当BH4合成被抑制后，iNOS蛋白表达明显降低，即DN小鼠肾皮质iNOS的蛋白表达受BH4的调控。

2.4 小鼠肾皮质中iNOS活性 DN组小鼠肾皮质中iNOS活性明显高于NS组小鼠（P＜0.05）；DAHP组iNOS活性明显低于 DN组（P＜0.01）（Fig 3）。表明DN小鼠肾皮质中iNOS活性明显增高，当BH4合成被抑制后，其活性明显降低。

Fig 2 Expression of iNOS protein in renal cortex of mice

Fig 3 Activity of iNOS in renal cortex of mice

2.5 小鼠肾皮质中NO水平 DN组NO水平明显高于NS组，差异有统计学意义（P＜0.05），DAHP组的NO水平明显低于DN组（P＜0.05）（Fig 4）。表明DN小鼠肾皮质中NO水平明显增高；当BH4合成被抑制后，NO生成减少。

Fig 4 NO level in renal cortex of mice

3 讨论

糖尿病已经成为全球流行疾病，其中2型糖尿病占糖尿病总体人群的95%以上［4］。DN是2型糖尿病最常见的并发症，也是2型糖尿病患者的主要死亡原因之一。2型DN的发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。研究表明，长期的高血糖所致的细胞因子的表达失衡、氧化应激以及由此引起的肾脏血流动力学异常在2型DN病程中起着非常重要的作用。

NO是一种重要的生理、病理性因子，它可扩张血管，改变肾血流量、增加肾小球滤过率。目前国内外学者对NO在DN中的利弊作用说法不一［5－8］。但是有大量研究表明，NO的过量生成是DN肾小球高内压、高灌注、高滤过的主要原因，直接促进蛋白尿的产生，降低异常增高的NO的生成可有效减少尿蛋白的生成［7－8］。本研究也发现，DN小鼠肾皮质中NO水平明显增高，24 h尿量及尿蛋白也明显增加。因此有效降低NO很可能是防治DN肾损害的新的切入点。

NO由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸而产生。NOS可分为两大类，一类是构成型一氧化氮合酶（constitutive NOS，cNOS），包括内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）和神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS），其产生的基础NO主要参与正常的细胞内信号传递；另一类是诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），只在细胞受到病理性刺激如微生物内外毒素、氧化应激、炎症介质（TNF-α、IL-1）等的伤害后才表达［9］。且 iNOS一旦表达，其活性将持续数小时，产生的NO是eNOS和nNOS的100～1 000倍。此时，异常增高的NO可造成组织损伤［10］。大量研究证实，DN肾皮质中eNOS蛋白表达明显降低［11－12］。以 eNOS基因缺陷引起的eNOS表达降低已成为目前DN动物模型之一［13－15］。而nNOS通常表达于神经组织中，在肾皮质中表达较少。因此，DN中异常增高的NO可能由iNOS的改变引起。为此，本研究检测了iNOS的蛋白表达及酶活性。结果显示：DN肾皮质中iNOS蛋白表达及酶活性明显增高，这可能是导致DN肾皮质中NO异常增高的主要原因。

BH4作为NO合成的关键酶iNOS的必要辅因子，具有稳定iNOS结构、增加L-精氨酸和iNOS结合力等作用。目前有关BH4的研究多数关注于其缺陷造成的内皮功能障碍，它的缺乏可产生多种疾病［16－18］。但是近年来有学者表明，BH4的异常增高可引起线粒体功能障碍，从而造成活性氧的恶性循环，组织损害作用更强［19］。很多疾病如白癜风、恶性贫血、神经退行性疾病等与BH4的异常增高密切相关［19－21］。在本研究中，我们发现2型DN小鼠肾皮质中BH4水平明显增高，iNOS表达明显增强。当采用GTPCHI（BH4合成的限速酶）抑制剂阻断BH4合成后，2型DN小鼠肾脏中iNOS及NO含量明显降低，这表明DN肾皮质中增高的BH4可能是造成iNOS表达增强的主要原因。因此，有效保持BH4平衡对机体微环境的维持是非常重要的。减少2型DN肾皮质中BH4的量可有效降低iNOS及NO的水平，进而降低尿量及尿蛋白。同时我们发现DAHP组体重较DN组明显下降，表明抑制BH4的合成可对2型DN的升高的体重有所改善。但是DAHP对血糖、肌酐没有影响，这将值得我们进一步探索其机制。

综上，在自发性2型DN小鼠肾脏中，BH4含量明显增加，进而可使iNOS蛋白表达及酶活性增加，从而导致NO生成增多，这与2型DN的多尿及蛋白尿密切相关。因此，BH4很可能是防治2型DN的治疗靶点之一，这值得我们进一步深入研究。

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