肠道病毒71型在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征

齐向云，李康，夏燕平，杨静，戴岳

1.中国药科大学 中药药理教研室，江苏 南京 211198；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850；3.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124；4.河南中医学院 药学院，河南 郑州 450008

肠道病毒71型（enterovirus type 71，EV71）属小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（En⁃terovirus），是单股正链RNA病毒[1]。该病毒是引起手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）的病原体之一，与其他能引起HFMD的病毒的不同之处在于EV71具有嗜神经毒性，易引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、心肌炎等并发症，且易导致患儿神经系统发育迟缓和认知功能减退[2-3]。EV71颗粒呈球形，直径24～30 nm，无包膜和突起，衣壳为正20面体对称，由60个相同的亚单位构成，每个亚单位包含VP1～VP4等4种衣壳蛋白，其中VP1～VP3暴露在病毒颗粒表面，VP4包埋在衣壳内侧，与RNA核心紧密连接[4]。目前认为EV71的复制机制与脊髓灰质炎病毒（poli⁃onyelitis virus，PV）高度相似[5]。由于宿主细胞内缺乏EV71基因组复制必需的酶，病毒进入宿主细胞后不能立刻开始基因组的复制，而是先进行转录和翻译。首先，EV71与细胞膜受体结合后，病毒颗粒空间构象发生改变而丢失VP4，同时使宿主细胞膜穿孔，最终病毒脱去外壳并释放病毒核酸进入胞质溶胶，开始病毒多肽的翻译[6-7]。EV71基因组RNA可直接被靶细胞的多核糖体翻译，首先直接翻译出一个多聚蛋白（2193个氨基酸残基），多聚蛋白在合成时又被自身水解产生的蛋白酶切割成前体蛋白（P1、P2和P3），前体蛋白再经加工形成病毒的结构蛋白（VP1～VP4），以及具有不同酶活性、特殊功能及未知功能的非结构蛋白（3C或3CD、3AB或3A和3B、3D，以及2A、2B和2C）。其中非结构蛋白3D形成RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA poly⁃merase，RdRp）。随后，RNA模板在RdRp的作用下合成负链RNA，再以负链RNA为模板在细胞内质网进一步合成大量正链RNA，随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，子代病毒颗粒开始组装[8]。EV71在宿主细胞中繁殖和复制的同时，还抑制宿主细胞DNA修复和蛋白质的合成，促进宿主细胞的凋亡[7]。EV71在不同细胞中的增殖动力学研究，对抗EV71药物作用机制研究等具有一定的指导作用。其中EV71在RD细胞中的增殖动力学已有比较系统的研究[9]，但依旧缺乏噬斑方面的数据，而EV71在Vero细胞中的增殖动力学研究还未见报道。

病毒噬斑又称蚀斑，是病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，一个噬斑为一个病毒体的繁殖后代品系。噬斑试验是一种可较精确地测定病毒感染力的方法[10]。在此，我们对比讨论了培养基类型、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、胎牛血清（FBS）、牛血清白蛋白（BSA）及甲基纤维素（MC）浓度对EV71噬斑形成的影响，进一步利用最适营养覆盖物配比进行噬斑实验，比较了EV71在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征，为研究EV71感染复制机制及抗EV71药物研究提供参考和支持。

1 材料与方法

1.1 材料

EV71为国际标准BrCr株，由解放军302医院貌盼勇教授惠赠，-70℃保存；人胚胎横纹肌肉瘤（RD）细胞为本实验室保存，用含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液培养；非洲绿猴肾（Vero）细胞由中国药品生物制品检定所赠送，用含10%FBS、1%双抗的MEM培养液培养。细胞培养条件为37℃、5%CO2贴壁培养，3 d传代1次。

HEPES缓冲液（1 mol/L）、双抗（青霉素1×104U/mL，链霉素1×104μg/mL）、MEM和DMEM培养液均购自迈晨生物科技公司；FBS为Hyclone公司产品；0.25% 胰酶-EDTA、MEM和DMEM干粉为GIB⁃CO公司产品；MC为Sigma公司产品；RIPA裂解液购自北京康为世纪生物科技有限公司。

CO2细胞培养孵箱、生物安全柜、-70℃冰箱、超净工作台均为Thermo Forma公司产品；Mili-Q超纯水系统为MILIIPORE公司产品；Typhoon 9410扫描仪为Amersham公司产品；制冰机为SANYO公司产品；倒置显微镜为Olympus公司产品。

1.2 甲基纤维素营养覆盖物的配制

MC覆盖物：2×培养液与2%MC溶液按1∶1混合（其余成分如FBS、HEPES和双抗等按照需要量预先溶解到2×培养液中），用力摇匀，静置数小时后分装，4℃备用。

2×培养液：MEM干粉9.6 g用500 mL高压过的Mili-Q超纯水溶解，加入NaHCO3粉末2 g溶解完全，再用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl溶液调pH值为7.0～7.2，用0.2 μm滤器过滤，4℃备用。

2%MC溶液：4 g MC粉末用200 mL热的Mi⁃li-Q超纯水（75～100℃）分散后，室温持续搅拌至液体成透明的均匀黏稠物，高压灭菌，4℃备用。

1.3 噬斑实验

Vero细胞以3.5×105/孔接种到 12孔板，次日待细胞长至致密单层，用病毒稀释液以400 μL/孔感染Vero细胞，于37℃、5%CO2条件下孵育1 h，吸弃病毒稀释液，用PBS洗2次，加入MC营养覆盖物，37℃、5%CO2孵育，每日观察噬斑情况，待噬斑明显且不再增多时（第4 d），用4%甲醛溶液固定，用1%结晶紫溶液染色，计数。噬斑形成单位（PFU/mL）=噬斑数×病毒稀释度×1 mL/400 μL。

1.4 EV71在RD和Vero细胞中的增殖动力学特征

病毒以MOI=0.1分别接种RD细胞和Vero细胞，37℃、5%CO2孵育1 h后吸弃病毒液，PBS洗2次，加入含2%FBS的培养液于37℃、5%CO2条件下孵育，分别于接种后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60和72 h收集细胞培养液（RD细胞收集到接种后第48 h），噬斑法分别计算病毒滴度。

1.5 实验数据处理

实验数据用SPSS17.0软件包处理，数值变量采用x±s进行统计描述，以P＜0.05为有统计学意义。不同时间点培养液中病毒滴度用噬斑形成单位（PFU/mL）表示，病毒滴度取以2为底的对数后与所对应的时间作图[9]进行分析。

2 结果

2.1 培养基规格及FBS含量对噬斑形成的影响

不同规格（1×或2×）的MEM或DMEM培养液与2%MC溶液对比混合均匀配制成营养覆盖物，含终浓度为1%的双抗、10 mmol/L的HEPES缓冲液和2%（或10%）的FBS。病毒稀释至1/104后感染12孔板中的Vero细胞单层进行噬斑实验。结果表明，DMEM（1×）和MEM（1×）与2%MC对半混合配制成的营养覆盖物，终浓度含2%或10%FBS均不能形成噬斑；DMEM（2×）和MEM（2×）与2%MC对半混合配制成的营养覆盖物，含2%FBS可以形成噬斑。

2.2 营养覆盖物中HEPES缓冲液、FBS和BSA对噬斑形成的影响

图1 培养基规格及FBS含量对噬斑形成的影响（100×）

2×培养液与2%MC对半混合均匀，配制成终浓度含有或不含HEPES缓冲液（10 mmol/L）、2%FBS和0.2%BSA的营养覆盖物。病毒稀释至1/104后感染12孔板中的Vero细胞单层，用含不同成分的营养覆盖物进行噬斑实验。结果显示，终浓度含2%FBS的覆盖物，病毒滴度（PFU/mL）取对数后为（5.53±0.02），终浓度不含FBS的营养覆盖，病毒滴度取对数后为（3.76±0.06），含血清与不含血清存在显著性差异（P＜0.001）；覆盖物中加入HEPES缓冲液与BSA不能显著增加噬斑形成单位（P＞0.05）（图2）。

2.3 MC溶液浓度对噬斑形成的影响

2×培养液分别与不同浓度MC溶液对半混合均匀，配制成营养覆盖物，终浓度含10 mmol/L HEPES缓冲液、1%双抗，2%FBS。EV71分别稀释至1/103、1/104和1/105后感染12孔板中的Vero细胞单层，分别用终浓度含0.5%、0.8%、1%或1.2%的MC的营养覆盖物进行噬斑实验。结果发现，病毒稀释度为1/104和1/105时，含1%MC的营养覆盖物出斑最多，含 0.8%MC的覆盖物次之；其中含1.2%MC的营养覆盖物的噬斑直径最小（图3）。

2.4 EV71在RD和Vero细胞中的增殖动力学特征

镜下观察，RD细胞在接种EV71 48 h内细胞即可完全凋亡，Vero细胞在接种病毒60 h后全部凋亡。噬斑实验统计结果，EV71接种RD细胞或Vero细胞12、24、48（和60）h后病毒滴度分别出现一个陡升。其中，RD细胞在接种EV71后第3 h病毒滴度即开始升高，且迅速进入指数增加阶段，12 h后病毒滴度增加约256倍，此时镜下观察RD细胞出现明显的病变，12 h后病毒滴度增殖速度逐渐下降，直到RD细胞全部凋亡（约48 h），测得病毒滴度增加262 144倍。而在Vero细胞中，EV71的增殖曲线比较温和，接种细胞后第3～6 h病毒滴度升高得比较缓慢，在接种后9～12 h开始呈指数增高，12 h后病毒滴度增加约16倍；接种EV71后第12～24 h，病毒滴度的变化与前12 h情况相似，24 h测定的EV71滴度较第12 h增加约12倍，此后Vero细胞开始发生明显的病变及凋亡，病毒增殖速度逐渐下降，第60 h后病毒滴度达到平台期，最终，病毒滴度增加2048倍（图4）。

图2 营养覆盖物中加入FBS、HEPES和BSA对噬斑形成的影响（x±s，n=3）

图3 MC溶液浓度对噬斑形成的影响

图4 EV71在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学（x±s，n=3）

3 讨论

细胞密度及生长状态是噬斑形成的关键因素之一，细胞生长密度过高或状态不好，容易凋亡、脱落，细胞密度过低亦不宜形成噬斑。血清质量对细胞生长代谢速度及生长状态的影响较大，继而影响噬斑形成单位及形成周期。因此，为保证实验的可重复性，应尽量使用同一类型相同批号的血清。在病毒噬斑形成实验中，BSA对含血清营养覆盖物而言为非必需成分。另外，不同直径的病毒颗粒对MC浓度的要求不同，浓度太高或太低都会减少噬斑数，且MC密度越大，噬斑直径越小。本实验结果显示，EV71在RD细胞和Vero细胞内增殖周期均约为12 h，这与文献[9]关于EV71在RD细胞内增殖周期的报道相符。其中，EV71在RD细胞中的增殖代谢活动比较活跃，在接种后第3～6 h即有大量病毒颗粒释放出细胞进入培养液，在第1个增殖周期（约12 h）完成后病毒滴度增加约256倍，此时RD细胞即出现典型的细胞病变效应（CPE），48 h以内细胞即完全凋亡。而EV71在Vero细胞中的增殖曲线相对较平缓。总之，在相同病毒感染复数情况下，EV71在RD细胞中的增殖活动较Vero细胞中活跃，增殖效率高。EV71在RD细胞和Vero细胞中增殖曲线的绘制，为研究EV71感染复制机制及抗病毒药物研究提供了参考。

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