microRNA与结核病诊断的研究进展

郄霜，张庆波，冯晓燕

1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850；2.河北联合大学，河北 唐山 063000

结核病是人类最古老的传染病之一，至今依然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病发病人数居世界第二，结核病报告发病人数始终位居法定报告甲、乙类传染病前列[1]。因此，对结核病患者实行早发现、早诊断、早治疗，一直是结核病研究工作的重点。

目前结核病的诊断方法主要有细菌学检测、皮肤试验、细胞因子检测、抗酸检测、抗原和抗体检测等，但这些方法存在着耗时较长、对样本的保存条件要求较高或检出率不高等缺陷，一直困扰着结核病的诊断和治疗。研究发现，一些microRNA（miRNA）能稳定地存在于结核病患者的血清中，部分miRNA表达会发生上调或下调[2]，可作为诊断结核病的依据。另外，在结核病患者的痰液中也存在能够被检测出的miRNA[3]，该项研究的发现为临床早期诊断提供了新的思路。

1 miRNA及其生物学功能

miRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体的非编码单链调节RNA，长度约为22（18～25）个核苷酸，是由一段具有发夹环结构的长度为70～80核苷酸的单链RNA前体剪切后生成的短序列。miRNA以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是通过阻遏或降解相应的mRNA使蛋白质的表达水平发生变化，从而在体内代谢过程中起到多种调控作用[4]。

在感染性疾病中，人们发现感染的病毒或细菌能够通过基因沉默机制躲避宿主免疫系统的监视，并且可以依靠miRNA对抗宿主细胞的免疫反应[5]。作为基因表达的调控因子，每个miRNA可以调节数百个靶基因，其在细胞增殖、分化、凋亡，及发育、器官形成等一系列生命过程中发挥着重要作用[6]。通过基因芯片筛选，在结核病患者中有771个基因发生差异表达，其中407个基因表达上调，364个基因表达下调，这771个基因受12个miRNA调控。一些miRNA在有毒力和无毒力的结核分枝杆菌中也会发生不同的调控作用。如miRNA可以调控凋亡调节蛋白BCL2基因的编码，在结核分枝杆菌无毒菌株侵染的情况下，刺激巨噬细胞凋亡，可避免细菌逃离免疫系统识别。与此相反，在有毒力结核分枝杆菌侵染情况下，引起巨噬细胞进行程序性细胞死亡，细菌可以从细胞膜中渗透出去，躲避免疫系统识别，进行传播[7]。总之，miRNA可能在基因表达调控领域起着超乎预料的作用。

在结核病的发生发展机制中，miRNA不仅可以通过标记到基因上进行靶向调控，也可以通过高甲基化抑制免疫系统调控。miRNA表达也会受到甲基化的调控。DNA甲基化是一种酶介导的化学修饰，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应。miRNA高甲基化与一些抑制免疫系统调控的基因甲基化密切相关，当利用甲基化抑制剂降低某些miRNA甲基化水平时，可以达到使该miRNA靶基因表达上调的目的。如在一些肺部疾病中 miR-9-1、miR-124a3、miR-148、miR-152和miR-663均发生了不同程度（34%～86%）的甲基化异常[8]。

2 miRNA在肺结核病诊断中的应用

2.1 miRNA在潜伏性肺结核病诊断中的应用

潜伏性肺结核（latent tuberculosis infection，LTBI）通常是指肺内存在结核杆菌，皮肤结核菌素试验呈阳性，但未出现明显的临床症状和影像学改变。全球结核菌感染者中，超过90%表现为潜伏性结核感染，有85%～90%新诊断的活动性肺结核由LTBI演变而来[9]。因此，LTBI的早期诊断日益受到重视，对我国结核病的预防和控制具有重要意义。

Wang等[10]比较了潜伏性和活动性肺结核患者的miRNA表达情况，发现与活动性肺结核患者相比，LTBI患者血清中的 miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p表达降低。miR-155直接受Foxp3调节，Foxp3通过靶向抑制作用抑制细胞因子信号1（SOCS1），是保证T细胞中IL-2含量的关键因素[11]。当机体受结核分枝杆菌侵染时，体内的免疫球蛋白类物质受损，从而导致胞嘧啶核苷脱氨酶被活化诱导，推动Th2细胞在T细胞中发挥功能，导致miR-155的表达降低[12]。miR-181被证明在B细胞分化过程中起正调节作用，当体内有结核分枝杆菌侵入时miR-181表达异位，导致CD19、B细胞和T细胞伴随减少[13]。

潜伏性结核病感染患者中Toll样受体10（Tolllike receptors-10，TLR10）显著上调，这与miR-146a有关。当受脂多糖刺激后，miR-146a和miR-146b转录上调，但只有成熟的miR-146a表达上调，miR-146a可以靶向TLR信号通路，影响其表达[14-15]。这些都说明，通过对miRNA水平分析，有可能达到早期诊断潜伏性肺结核病并加以控制的目的。

2.2 miRNA在活动性肺结核病诊断中的应用

Fu等[16]用miRNA芯片技术检测了活动性结核患者血循环中的miRNA，在所检测的1223个miRNA中，有95个在痰液中差异表达；有92个在血清中差异表达，其中59个为高表达、33个为低表达。结核患者血清与正常血清相比miR-3125低表达，而miR-93*和miR-29a高表达，表明miR-29a有可能是活动性结核病诊断的重要指标。一些研究结果显示，miR-155和miR-155*也是迄今诊断结核病效果较好的潜在指标[17]。与潜伏性肺结核相比，活动性肺结核患者血清中显著表达的miRNA有miR-144、miR-424、miR-451、miR-21*、miR-486-5p等12个，其中miR-144的表达增高尤为明显[18]。这些表明了miRNA在活动性肺结核感染中存在功能，为今后结核病的诊断与防治提供了新方法和新思路。

最新的一项研究表明，miR-99b在结核分枝杆菌H37Rv株感染的树突状细胞和巨噬细胞中表达水平上调。但随着结核分枝杆菌在树突状细胞中数量的增长，miR-99b的表达会被抑制，与此同时细胞因子IL-6、IL-12等的含量会增加[19]。在结核杆菌感染的巨噬细胞中miR-29A的表达上升，主要干扰素-C对巨噬细胞内感染的细菌进行抑制免疫反应，使miR-29A的表达量上升[20]。而Ma[21]等通过实验筛选到了结核分枝杆菌感染后在Ⅱ型干扰素分泌型免疫细胞中显著下调的miR-29。通过体外实验证实了miR-29家族成员均可以直接靶向γ型干扰素的3'非翻译区，从而抑制其表达。

miRNA在活动性肺结核病患者的痰液中能够稳定存在[22-23]，在许多肺部疾病，如肺癌和慢性阻塞性肺部疾病患者的痰液中会产生特有的miRNA[24]。有些miRNA在活动性结核病患者的痰液和血清中没有显著差异表达，如miR-150和miR-155[25]。血清与痰液中的差异表达miRNA也存在不一致性，例如，与对照组比较，miR-19B-2*和miR-3179在活动性结核病患者的痰液中表达量很高，而miR-518D-5p和miR-93在活动性结核病患者的血清中表达量很高。

3 结语

众多miRNA参与肺部疾病发展进程，在基因的表达调控中起关键作用，受到越来越多的重视。通过对血清和痰液样品中的miRNA进行检测，可以实现诊断结核病的目的，有着重要的意义。作为新的标志物，随着对miRNA研究的不断深入，相信会有更多关键的miRNA被发现，也会有更准确、更方便的关于miRNA的检测方法被研发，为结核病诊断与治疗提供更多帮助，推动结核病诊断与治疗的发展。

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