人冠状病毒感染的血清学检测技术进展

郝春绪，沈晓玲，谭文杰

1.内蒙古医科大学 基础医学院微生物学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110；2.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 102206

冠状病毒属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，在电子显微镜下呈日冕冠或皇冠状，故得名[1]。目前冠状病毒被分为4个属，即α冠状病毒属（A系和B系）、β冠状病毒属（A～D系）、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属[1]。冠状病毒是有包膜的正链RNA病毒，基因组全长25～32 kb，是已知所有RNA病毒中基因组最大的[2]。病毒基因组的两端分别包含一个非翻译区（5'-UTR和3'-UTR），其中5'端约3/4包含2个大的重叠的开放读框ORF1a和ORF1b，主要编码与病毒复制转录有关的酶类等非结构蛋白，3'端约1/4的基因主要编码表面棘突（spike，S）蛋白、膜（mem⁃brane，M）蛋白、小包膜（small envelope membrane，E）蛋白及核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白等主要结构蛋白[2]。

1 人冠状病毒感染概述

冠状病毒感染是一类动物源性疾病，宿主范围广泛，与人和动物的许多疾病有关[1-3]。2012年前发现的人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）包括HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-HKU1[3-5]，其中HCoV-NL63和HCoV-229E为α冠状病毒，SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoVHKU1均为β冠状病毒。2012年在中东地区新发现的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）为第6种人冠状病毒[6]。在6种人冠状病毒中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1等4种在人群中普遍存在并呈全球性分布，通常引起急性呼吸道症状，主要表现为发热、咳嗽、流涕，严重者表现为喉炎、支气管炎、毛细支气管炎及肺炎等，也有导致胃肠道与神经系统症状的报道[1-3]。2003年起源于我国广东的SARS-CoV曾在全球多个国家与地区暴发流行，主要引起成人急性呼吸道症状，严重者造成死亡[4-5]，但2005年迄今已无新的感染病例报道。而2012年新发现的MERS-CoV，感染者的主要症状表现为重症急性呼吸道感染并伴发肾功能衰竭[6]，截至2014年1月10日，WHO报道全球实验室确诊177人感染，74人死亡，存在隐性感染病例与有限人际传播能力[7]。

高致病性的SARS-CoV与MERS-CoV分离培养须在生物安全三级实验室进行，而其他4种HCoV的分离培养技术难度较大，不适于常规实验室诊断。目前人冠状病毒感染的实验室诊断主要有核酸检测与血清学检测[5，8-9]。RT-PCR与荧光定量RT-PCR等核酸检测技术能在人冠状病毒感染的早期进行快速诊断，是目前应用最为广泛的技术，但它在很大程度上依赖于有经验的技术人员和专业实验室设备，易污染；而血清学检测方法不仅可用于感染诊断，并可监测感染者体内特异性抗体的变化情况及既往感染规律、人群易感状况等流行病学数据，可为疾病的防治与疫苗研发提供参考依据[8-10]。

2 人冠状病毒感染的血清学检测技术

人冠状病毒感染的血清学检测技术目前主要包括[8-20]：针对冠状病毒的主要结构蛋白（N和S蛋白）等，采用间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫法（ELISA）、蛋白印迹等技术检测特异性结合抗体（IgG与IgM）；检测血清中和抗体的基于真病毒或假型病毒的体外微量中和试验[15-16]。此外，因N蛋白为冠状病毒结构蛋白中含量最丰富和保守的蛋白质，常在感染早期病人血清中出现[12]，可制备N蛋白特异性单抗，建立双抗体夹心EIA检测血清中的N抗原。

2.1 抗体检测

2.1.1 抗原的选择与优化 结构蛋白是冠状病毒血清学抗体检测的主要候选抗原[8-19]，其中报道最多的是N和S蛋白，而M和E蛋白的报道较少[8-15]。因人冠状病毒全长N蛋白序列本身在各病毒间存在一定的保守性，作为抗原检测血清抗体易导致交叉反应与假阳性，须进行抗原优化。如原核表达的全长SARS-CoV N蛋白，作为抗原检测人群中血清抗体，无论是采用EIA还是蛋白印迹法，均可发现与其他冠状病毒（HCoV-229E与HCoV-OC43）存在交叉反应[20-22]。如将全长SARS-CoV N蛋白抗原分为3段，即N1（1～422 aa）、N2（1～109 aa）和N3（110～422 aa）进行表达纯化，结果显示采用N1、N3作为候选抗原可更好地提高血清学检测的特异性[19]。若将N蛋白分成39个不同片段，从中选择6个片段PN360（1～360 aa）、PN301（1～301 aa）、PN199（30～228 aa）、PN185（30～214 aa）、PN155b（60～214 aa）和 PN125（90～214 aa）进行抗原性研究，结果显示在6种片段中，PN185和PN155b更适合作为候选抗原进行SARS特异性血清抗体的检测[21]。

相对于N蛋白，截短型S蛋白作为抗原检测血清抗体具有更高的特异性[22]。采用人冠状病毒S蛋白作为抗原检测血清抗体，很少有存在交叉反应的报道[10-11，14]。研究证明，冠状病毒S蛋白的受体结合区（RBD）包含多个构象的抗原，可以诱发机体产生高滴度的中和抗体[15-16]。相对于全长S蛋白，截短型S蛋白或RBD更易于在大肠杆菌及各种真核系统（如昆虫杆状系统或293T细胞）中得到高效表达，获得构象合理的纯化蛋白，可作为特异敏感检测感染后血清抗体的候选抗原[15-18]。应用S蛋白和N蛋白的融合片段作为抗原，可以提高血清学检测的特异性[23]。2009年，Gimenez等以S蛋白的251～683 aa片段和N蛋白（除了25个C端氨基酸残基序列）组成的4种人工合成多肽混合物为抗原进行了血清学筛查，敏感性和特异性均达90%以上，而混合的多肽作为候选抗原比单个肽更适合血清学的检测[23]。

目前，关于各HCoV抗原的选择与优化仍是抗体检测的关键技术问题。

2.1.2 常见的人冠状病毒感染血清学抗体检测技术 实验室常用的人冠状病毒血清学抗体检测技术包括ELISA、IFA、蛋白芯片、蛋白印迹及中和实验等，每种方法存在着各自的优势和不足[8-29]。ELISA目前已广泛用于人冠状病毒（尤其是SARS-CoV）感染的血清学诊断[8-9]，其优点是经济、快速、简便、敏感性强、特异性高[18-19，23]。相对于 ELISA，IFA 更易建立，因后者无须获得纯化的蛋白抗原，尤其是难于表达纯化的糖蛋白结构抗原，可通过构建真核表达质粒转染细胞而直接进行检测[8，14，26-27]。蛋白印迹法应用于冠状病毒的血清学抗体虽有不少报道[13，22]，但由于操作繁琐，不易标准化，目前很少推广应用。面对2012年新发现的MERS-CoV感染，最先建立的血清学抗体快速检测手段即为间接免疫荧光法[27]，随后建立了检测特异性抗体的蛋白芯片法与高通量操作安全的基于假病毒的体外微量中和检测法[28-29]。对于难培养或高致病性的人冠状病毒感染，建立基于假病毒的体外中和抗体检测方法，不仅可敏感、特异、高通量检测中和抗体[15-16,29-30]，因其不需要在生物安全三级实验室中完成，还非常适合大范围的血清流行病学研究，同时可以使我们更好地理解MERSCoV的生态学和流行病学[29,31]。

2.2 抗原检测

人冠状病毒抗原检测主要针对人冠状病毒的结构蛋白，通过制备基于结构蛋白的单抗或多抗，采用特异的双抗体夹心技术检测血清中相应抗原的含量，目前报道多为检测SARS-CoV的N抗原[32-41]。2004年国内学者车小燕筛选制备了多株SARSCoV N蛋白特异的单抗，并建立了通过检测血清中N抗原早期诊断SARS-CoV感染的ELISA检测试剂盒，在临床得到广泛应用[33-34]。Shin等运用昆虫细胞表达的SARS-CoV N蛋白制备了17种单抗，筛选了3种针对N端的单抗和2种针对C端的单抗，发现它们与其他人冠状病毒的N蛋白没有交叉反应，证实这些单抗对SARS-CoV临床诊断试剂盒的开发很有价值[32]。化学发光检测冠状病毒抗原，可以快速、敏感地检测到2 pg/mL浓度以下的目的蛋白。Fujimo⁃to等制备了与化学发光相结合的单抗，检测SARS病人鼻咽抽取液中的N蛋白，发现它们与普通冠状病毒（229E、NL63、OC43）的重组N蛋白没有交叉反应，与感染229E、NL63、OC43的溶解产物均没有交叉反应。作者同时检测了18份阳性标本和20份阴性标本，发现其敏感性和特异性均达到100%，远高于以前的ELISA和RT-PCR检测技术[35]。近期Kammila等建立了一种针对SARS-CoV N蛋白的双功能单抗和鸡多抗的Immunoswab方法，可在40～60 min发现病人体液中的N蛋白，是一种非常实用的方法[36]。Palaniyappan等将在大肠杆菌中表达的SARS-CoV全长N蛋白制备出鼠单抗和鸡多抗，结果显示2种针对N蛋白的抗体都很敏感，最重要的是使用鸡多抗不仅在检测抗原方面非常敏感，而且价格很便宜，是一种具有开发前景的诊断试剂[37]。最近也有学者报道了通过建立双抗体夹心ELISA检测抗原的方法，可鉴别诊断2种常见Ⅰ型人冠状病毒（HCoVNL63与HCoV-229E）感染[38]。

除了双抗体夹心ELISA方法外，近年来许多新的分子（核酸适配体）或电化学标记技术也应用于SARS-CoV N抗原的检测，并呈现出超高灵敏度与自动化检测应用前景[39-41]。此外，通过制备筛选S蛋白特异性单抗，也可建立灵敏特异地检测SARSCoV S抗原的双抗体夹心ELISA方法[42]。

3 结语

综合上述进展可以看出，自2003年SARS暴发至今，通过各国科学家的积极努力，人冠状病毒在血清学方面的研究在近几年已获得了众多进展，尤其是目前SARS-CoV感染的血清学检测技术比较成熟，已建立试剂评价的血清盘[43]，相关诊断试剂盒已批准上市并已得到广泛应用。但其他人冠状病毒（如新发的MERS-CoV）感染的血清学检测技术仍在发展与应用评价中，主要的瓶颈是缺乏合适的血清标准品，有很多血清学应答特点（抗原的选择与优化，血清抗体交叉反应等）还需要深入研究。为有效防控近期新发的MERS-CoV的感染传播，尽快建立检测MERS-CoV感染的抗体、抗原等血清学检测方法，并对MERS-CoV的中和抗体进行深入研究，已成为目前人冠状病毒研究领域的当务之急。

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