荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量

刘晶晶，郭莹莹，李艳琪，王文文，吴祖泽，靳继德

1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100022；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850；3.天津大学 化工学院，天津 300072

毕赤酵母不但具有繁殖快、易培养、培养基廉价和试验过程简单可行等优点，而且具有强启动子、可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰的特点，因此具备了典型的真核生物表达体系的条件。毕赤酵母已发展成一个较为理想的真核蛋白表达系统，在国内外被广泛应用于生产外源蛋白和生物制品，已有1000多种外源蛋白在毕赤酵母中获得表达[1]。目前，生物制品的生产大都借助原核或真核表达系统，但表达系统宿主又会带来一定的安全性问题，因此这些生物制品必须符合严格的质量标准[2-3]。宿主菌残留的DNA是此类产品中特有的潜在致癌性杂质，这些产品中外源性DNA残留量的控制是一个非常重要的指标[4-5]。《中华人民共和国药典》对生物制品中宿主DNA的残留量有明确规定，即原核表达系统生产的产品，DNA残留量标准是每人份不超过10 ng，真核细胞生产的产品其含量应不高于每人份100 pg，酵母表达系统生产的产品其含量不高于每人份10 ng[6]。酵母属真核生物，所以应制定更为严格的DNA残留量质量控制标准，以提高产品的安全性。药典推荐使用的外源DNA残留检测方法有斑点杂交法和荧光法。DNA杂交法实验操作周期长，步骤烦琐，干扰因素多，重复性差，且不能进行定量分析[7-8]，一次检测的样本量也比较有限。荧光法的检测灵敏度较低，检测范围为1～80 ng/mL。此外，针对DNA重组药物中残留的宿主DNA含量的测定方法还有基于DNA结合蛋白的Threshold Immuno⁃assay分析系统[9]及实时定量PCR法[10]。实时定量PCR（real-time PCR）技术自从1993年问世以来，就以其准确、灵敏度高、便捷、低污染等特点而被广大科研工作者广泛应用于基因表达分析、病原物和转基因产品检测等方面[11-13]。它既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点，还具有重复性好、省力、低费用等优点[14]。在本研究中，我们建立了基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时定量PCR检测方法，实现了对重组产品中毕赤酵母DNA残留量的快速、简便、高灵敏度的定量检测，可用于重组新蛭素等生物制品制备过程中的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料

毕赤酵母菌GS115为本室保存；5批注射用重组新蛭素为本实验室制备，均为毕赤酵母菌GS115表达生产的生物制品。SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）购自大连TaKaRa公司；PrepSEQ残留DNA提取试剂盒购自北京东方嘉诚科贸有限公司；酵母基因组提取试剂盒购自Promega公司；溶细胞酶（lyticase）购自天根生化科技公司；全自动荧光定量PCR_LightCycler480系统为Roche公司产品。

1.2 检测基因与扩增引物

选择毕赤酵母基因组中拷贝数高、染色体中分布广的5S rRNA基因作为扩增的目的基因，根据re⁃al-time PCR引物设计原则设计特异性扩增引物Primer 5S-sense（5'-GGTTGCGGCCATATCTAG-3'）和 Primer 5S-antisense（5'-AGATTGCAGCACCTGA GT-3'）[15]，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3 宿主菌基因组DNA标准品的制备

取毕赤酵母500 μL接种于100 mL YPD培养基中，30℃振荡培养至D600nm约为1.5，离心收集菌体，加入山梨醇缓冲液（0.12 mol山梨醇，用pH7.4的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液定容至100 mL）300 μL、溶细胞酶（10 U/μL）10 μL，37℃摇床温育60 min，冷却至室温，离心弃上清，用酵母基因组提取试剂盒提取宿主菌DNA，分别用异丙醇沉淀和70%乙醇洗涤去掉酵母基因组DNA中的脂溶性物质，最终得到的沉淀加入50 μL无菌水和1.5 μL RNase，37℃温育15 min，65℃温育1 h或4℃过夜，得到酵母基因组DNA，保存在-20℃，用紫外分光光度法测定浓度及D260nm/D280nm值。

1.4 real-time PCR检测毕赤酵母DNA残留量方法的建立

将基因组DNA稀释成不同浓度的标准品（1000、100、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4pg/μL），取10 μL基因组DNA标准品为模板，以Prim⁃er 5S-sense和Primer 5S-antisense为引物，在全自动荧光定量PCR_LightCycler480系统中进行扩增，实时检测荧光强度。real-time PCR反应体系包括SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）（2 ×）12.5 μL、引物（10 μmol/L）各 0.5 μL、基因组 DNA标准品 10 μL、无菌 ddH2O 1.5 μL（DNA 聚合酶、PCR缓冲液、dNTP及SYBR GreenⅠ均已事先混合于商品化的SYBR Premix Ex Taq中）。经过优化的反应条件为：95℃预变性5 min激活Taq聚合酶，95℃变性5 s、55℃退火15 s、72℃延伸15 s，循环70次，55～95℃程序升温检测熔解曲线，进行荧光检测。

1.5 精密度和回收率测定

将1000 pg/μL的标准品DNA用灭菌注射用水稀释至1 pg/μL，平行做8孔，进行标准品的精密度测定；同时取供试样品稀释至20 mg/mL，平行做3孔，测定样品的精密度。为了测定DNA标准品在样品中的加样回收率，先用灭菌注射用水将样品溶液稀释至20 mg/mL，然后将标准品DNA分别稀释至1、1×10-1和1×10-2pg/μL，分别取5 μL标准DNA再加5 μL样品溶液作为待测样品1、2和3，每个浓度平行加样3孔，进行PCR反应，测定加样回收率。用全自动荧光定量PCR_LightCycler480系统进行数据分析结果。用下式计算DNA加样回收率。为了减少待测样品中的高浓度蛋白对PCR结果的干扰，应用DNA纯化回收试剂盒对DNA样品进行回收，观察回收对DNA含量测定的影响。

1.6 重组新蛭素制品中DNA含量的测定

根据每人次用剂量（20 mg），将所有供试样品均稀释到20 mg/mL进行测定，再利用回收率校正计算样品DNA残留量，用下式计算（x代表标准曲线的横坐标值，即样品浓度的对数）。

2 结果

2.1 宿主菌基因组DNA标准品的制备结果

利用紫外可见分光光度计检测酵母基因组DNA，以去离子水为空白对照，测得DNA浓度为527 μg/mL，D260nm/D280nm值为1.824。

2.2 real-time PCR定量检测标准曲线的建立

图1为1×10-4～1000 pg/μL的标准品DNA realtime PCR扩增曲线。可以看出1×10-1～1000 pg/μL标准品的扩增曲线平稳光滑，峰值较高，没有杂合的基因片段，且指数增长期、线性增长期及平台期呈现明显的“S”型曲线，标准品DNA扩增效率较高。而标准品低于1×10-2pg/μL时，虽然也可获得较好的扩增曲线，但重复性和扩增效率明显降低，而且当选取DNA浓度为1×10-2～1000 pg/μL制作标准曲线，所得标准曲线的误差值为0.271，大于0.2；选取DNA浓度为1×10-1～1000 pg/μL制作标准曲线，所得标准曲线的误差值为0.197。标准曲线的斜率为-5.055，截距为29.85，扩增效率为1.577。图2为实时荧光定量PCR的熔解曲线，可以看出DNA浓度为1×10-1～1000 pg/μL时可检测到单一明显的特异峰值，且无非特异性扩增杂峰及引物二聚体的低矮小峰出现，证明了产物的特异性。当浓度低于1×10-2pg/μL时，熔解曲线明显变得低矮，且形态发生了变异。PCR结束后，用PCR_LightCycler480系统进行数据分析，图3为标准曲线。样品浓度与循环阈值（Cp）之间的线性关系曲线表达式为Cp=-5.055x+29.85（x是标准品浓度取对数后的值），从仪器读取待测样品的Cp值，然后把待测样品的Cp值代入线性方程，就可以得到x值，算出其初始浓度。

图1 real-time PCR扩增曲线

图2 熔解曲线

2.3 精密度测定结果

DNA标准品含量为1 pg/μL时的精密度测定结果见表1，Cp值的RSD为3.09%，标准品测定结果平均值为0.71 pg/μL，RSD为48.39%。测定供试样品DNA残留量精密度结果见表2，平均值为2.7×10-4pg/μL，RSD为25.0%。

2.4 回收率测定结果

毕赤酵母DNA加样回收率测定结果见表3，标准品浓度为1×10-2～1 pg/μL时的回收率为32.4%～80.0%。对浓度分别为100、10和1 pg/μL的标准品经DNA纯化试剂盒纯化后进行回收率测定，结果见表4，标准品经过纯化后的回收率较低，原因可能是部分DNA在纯化操作过程中损失了。

2.5 供试样品DNA含量测定结果

图3 real-time PCR标准曲线

表1 用标准品测定精密度

表2 用供试样品测定精密度

5批注射用重组新蛭素（酵母）外源DNA残留量测定结果见表5。根据真核细胞表达产品对宿主DNA残留量的标准，每剂量蛋白质产品中DNA残留量应小于100 pg。注射用重组新蛭素的包装规格为20 mg/支，使用方法是用1 mL注射用水溶解后静脉滴注。因此，注射用重组新蛭素中毕赤酵母DNA残留量应小于0.1 pg/μL。依据加样回收率测定结果，当DNA含量约为0.1 pg/μL时回收率为50.0%，因此，为增加样品测定结果的准确性，测定结果用标准品回收率校正计算样品DNA的残留量。5批重组新蛭素（酵母）外源DNA残留量分别为0.03、2.3、0.2、0.6和0.2 pg/mg，换算成每剂量依次为0.6、46、4.0、12、4.0 pg，均远小于每人份剂量100 pg的要求。

表3 加样回收率测定

表4 标准品纯化后的回收率测定结果

表5 注射用重组新蛭素DNA含量测定结果

3 讨论

与斑点杂交法相比，实时定量PCR法检测DNA具有操作简便、周期短、可定量分析等优点；与荧光法相比，具有更高的灵敏度，检出限可达1×10-1pg/μL水平。而且采用实时定量PCR法可在短时间内（30 min～2 h）完成对多个样本的检测，是高通量快速定量检测宿主基因组DNA残留的理想方法[16]。

毕赤酵母5S rRNA具有21个拷贝，分布于全部的4条染色体上，高拷贝数的特点使其很容易被检测到，而分布的广泛性使其即使在基因组不完整的情况下也能被检测到，因此，5S rRNA基因适宜作为酵母DNA残留检测的目标基因[15]。

实时定量PCR技术应用了荧光染料或探针来保证扩增的特异性，荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而实现了真正意义上的定量检测。SYBR GreenⅠ荧光染料无特异性，只要是双链就会结合，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会结合产生荧光，相对于TaqMan探针法，通常本底较高，精确度稍差。但SYBR GreenⅠ能够与所有双链DNA结合，因而对不同模板不需要定制不同的特异性探针，其通用性较好，而且价格相对较低，适合作为常规的质控方法。因此，在满足灵敏度要求的前提下，采取一定措施（如优化引物设计、优化PCR反应条件等）提高PCR反应的特异性，即可克服上述缺点，实现最佳的检测效果。

SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR技术检测毕赤酵母5S rRNA基因，当DNA含量为1×10-1～1000 pg/μL时呈现良好的线性关系，即使DNA含量低至1×10-4pg/μL也可以得到扩增，因此该方法具有较高的灵敏度，可用于微量DNA残留的检测。应用建立的检测方法对5批注射用重组新蛭素（酵母）产品中残留的宿主基因组DNA进行测定，5批产品的外源DNA残留量均符合小于100 pg/剂量的质量标准。由于DNA残留量均在检出限附近，因此RSD值相对较大。通过增加实验复孔数量和重复次数，能够得到比较稳定而准确的检测结果。该方法是一种灵敏度高、较准确、简便快速的方法，有较好的应用和推广前景。

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